此申请是申请 Ser. 的分案申请。 2004 年 8 月 2 日提交的第 10/902,959 号，是申请序列号的部分延续。第 10/118,079 号，于 2002 年 4 月 9 日提交，要求加拿大申请 2,342,970 的优先权； 2,362,004；和 2,367,636，分别于 2001 年 4 月 12 日、2001 年 11 月 13 日和 2002 年 1 月 15 日提交。这些申请的全部内容通过引用并入本文。
本发明涉及包含例如C3样融合蛋白、C3嵌合融合蛋白的缀合物或融合型蛋白(多肽)。尽管本发明的融合型蛋白在下文中特别讨论了与促进轴突再生和神经保护有关的用途，但应理解融合蛋白可用于其他情况。
更具体地说，本发明涉及哺乳动物神经系统修复领域（例如，中枢神经系统（CNS）或周围神经系统（PNS）损伤部位的修复、轴突再生和萌芽、神经突长出以及防止神经变性和缺血性损伤。
视网膜是中枢神经系统的一部分，本发明涉及视网膜修复、视网膜神经保护、视网膜创伤和疾病以及视网膜局部缺血损伤。具体而言，本发明涉及可用于治疗眼部疾病的组合物和方法，例如黄斑变性（例如湿性黄斑变性和干性黄斑变性）、斯塔加特氏病、色素性视网膜炎、糖尿病性视网膜病、高血压性视网膜病、闭塞性视网膜病和其他疾病视网膜疾病，包括涉及异常血液和液体流动的疾病。
脊髓外伤会导致永久性功能限制。大多数与脊髓损伤相关的缺陷是由中枢神经系统 (CNS) 中受损的轴突丢失引起的。同样，中枢神经系统的其他疾病也与轴突的丢失和收缩有关，例如中风、人类免疫缺陷病毒 (HIV) 痴呆、朊病毒病、帕金森病、阿尔茨海默病、多发性硬化症和青光眼。所有这些疾病的共同点是轴突与其靶标的连接丢失和细胞死亡。刺激受影响或患病神经元群轴突生长的能力将增强失去的神经功能的恢复，并且防止细胞死亡可能会限制损伤的程度。例如，白质中风后，即使神经元细胞体还活着，轴突也会受损和丢失，而灰质中风会杀死许多神经元和非神经元（神经胶质）细胞。可有效诱导受伤轴突萌芽的治疗也可有效治疗某些类型的中风（Boston Life Sciences 新闻稿，2000 年 9 月 6 日）。神经保护剂经常被探索为可能限制中风后损伤的潜在化合物。既能促进生长又能保护神经的化合物特别适合治疗中风和神经退行性疾病。类似地，尽管下面的讨论一般涉及将 Rho 拮抗剂等递送至外伤性受损的神经系统，但本发明也可应用于未知原因造成的损伤，例如中风、多发性硬化症、HIV 痴呆、帕金森病、阿尔茨海默病、朊病毒病或其他中枢神经系统区域的轴突受损的中枢神经系统疾病。此外，Rho 是治疗癌症和转移瘤（Clark 等人 (2000) Nature 406:532-535）和高血压（Uehata 等人 (1997) Nature 389:990）的重要靶标，据报道 RhoA 对它具有心脏保护作用（Lee et al. FASEB J. 15:1886-1884）。因此，新的C3样蛋白有望用于多种需要抑制Rho活性的疾病。
已提议使用各种 Rho 拮抗剂作为诱导（切割）轴突再生的手段，即。 H。神经病变，刺激；参见，例如，加拿大专利申请号 2,304,981（McKerracher 等人）和 2,300,878（Strittmatter）。这些专利申请文件提出使用已知的Rho拮抗剂如C3、C3嵌合蛋白等。 （见下文）以及选自已知反式-4-氨基（烷基）-1-吡啶基氨基甲酰基环己烷化合物（也见下文）或用于轴突再生的 Rho 激酶抑制剂的物质。 C3 通过 ADP 核糖基化使 Rho 失活并且对细胞相当无毒（Dillon 和 Feig (1995) 酶学方法：小 GTP 酶及其调节剂部分 B.256:174-184）。
虽然以下讨论一般涉及或针对中枢神经系统的修复，但本文描述的技术可以扩展到用于许多其他疾病，包括但不限于癌症、转移瘤、高血压、心脏病、中风、糖尿病性神经病变和神经退行性病变中风、阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症 (ALS) 等疾病。用Rho拮抗剂治疗可用于增加周围神经的轴突生长速率，从而有效用于手术后的周围神经修复，例如在断肢重新接上之后。此外，由于其轴突生长促进作用，预计使用我们的融合化合物（蛋白质）治疗可有效治疗各种周围神经病。
如上所述，创伤性脊髓损伤会导致永久性功能障碍。成年哺乳动物 CNS 中不会发生轴突再生，因为底物结合的生长抑制蛋白会阻止轴突生长。许多化合物，如营养因子，可增强神经元分化并刺激组织培养中的轴突生长。然而，大多数促进生长和分化的因素无法促进轴突在抑制性底物上的再生生长。为了证明已知在组织培养中刺激轴突生长的化合物最准确地反映了其在中枢神经系统轴突再生中的治疗用途的潜力，重要的是细胞培养研究包括证据表明在生长时可以允许轴突生长的化合物是抑制底物。在组织培养中刺激允许底物生长的营养和分化因子的一个例子是神经营养因子，例如神经生长因子 (NGF) 和脑源性生长因子。然而，NGF 不促进抑制性底物的生长（Lehmann 等人（1999）19：7537-7547）并且在体内促进轴突再生方面无效。脑源性神经营养因子 (BDNF) 也不能有效地促进体内再生（Mansour-Robaey 等人，J. Neurosci. (1994) 91:1632-1636）。 BDNF 不会促进生长抑制底物上的神经突生长（Lehmann 等人，同上）。
已提议靶向涉及 Rho 和 Rho 激酶的细胞内信号传导机制以促进轴突再生（参见，例如，加拿大专利申请第 2,304,981 号（McKerracher 等人），上述）。为了证明 Rho 失活促进轴突在生长抑制底物上的再生，使用了重组 C3，一种通过效应域的 ADP-核糖基化使 Rho 失活的蛋白质。虽然这种C3蛋白可有效促进再生，但已发现这种C3蛋白不容易进入细胞，因此必须使用高剂量才能使其有效。促进功能恢复所需的高剂量重组 C3 代表了在体内使用 C3 促进再生的实际限制或限制（Lehmann 等人（1999）J. Neurosci. 19：7537-7547 Morii N 和 Narumiya S（1995） Methods in Enzymology vol 256 part B pp 196-206 to inhibit growth is inhibitory substrates is 25 µg/ml (Lehmann et al. (1999) J. Neurosci. 19:7537-7547; Morii, N. and Narumiya, S.（ 1995) Methods in Enzymology, Vol. 256, part B, pp. 196-206)。如果细胞没有被研磨，即使这个剂量也是无效的。McKerracher，加拿大专利申请号：2,325,842) 在计算需要的剂量时以用于大鼠和小鼠实验的体重秤等效剂量治疗成年人，有必要使用 120 mg/kg C3（即H。单独）对受伤的人体脊髓。由于大规模的蛋白质纯化和成本，所需的大量重组 C3 蛋白会产生重大的制造问题。它还限制了可测试的剂量范围，因为最小有效剂量需要大量蛋白质。
使用 C3 促进受损中枢神经系统修复的另一个相关限制是它不容易穿透活细胞的质膜。在组织培养研究中，当用于测试生物效应时，C3 被直接显微注射到细胞中（Ridley 和 Hall (1992) Cell 70:389-399）或通过研磨细胞来破坏质膜（Lehmann 等人， , (1999) J. Neurosci., 19:7537-7547, Jin 和 Strittmatter (1997) J. Neurosci., 17:6256-6263)。在体内轴突损伤的情况下，C3 蛋白可能会进入细胞，因为受伤的轴突很容易从其环境中吸收物质。然而，本发明的 C3 样蛋白也可能作用于周围未受损的神经元，帮助它们也建立新的连接，从而促进恢复。在不完全脊髓损伤后，运动系统的可塑性归因于皮质和皮质下水平，包括脊髓回路（Raineteau, O. 和 Schwab, M.E. (2001) Nat Rev Neurosci 2: 263-73）。这种可塑性可归因于侧枝的轴突或树突发芽以及突触增强或减弱。此外，已经表明，保留一些腹外侧纤维会导致运动性能的显着差异，因为这些纤维对于脊髓中枢模式发生器的运动模式的启动和控制很重要（Brustein, E. 和 Rossignol, S. (1998) J Neurophysiol 80:1245-67)。有据可查的是，在脊髓损伤后会发生剩余皮质脊髓侧支纤维的重组，这有助于功能恢复（Weidner 等人，2001 Proc. Natl. Acad. Sci. 98:3513-3518）。通过使用能够进入未受伤神经元的 C3 样蛋白进行处理，可以增强剩余纤维的重组和发芽过程。这将增强自发的轴突可塑性和树突重塑，已知这有助于功能恢复。
体外递送 C3 的其他方法是生产可通过受体介导机制摄取的重组蛋白（Boquet，P. 等人（1995）Meth. Enzymol. 256：297-306）。这种方法的缺点是待处理的细胞必须表达必要的受体。最后，将 C211 结合蛋白与 C21N-C3 融合毒素一起添加到组织培养基中能够通过受体介导的内吞作用摄取 C3（Barthe 等人（1998）Infection and Immunity 66：1364）。该系统的缺点是细胞中的大部分 C3 保留在膜室中。更重要的是，必须分别添加两种不同的蛋白质才能进行运输（Wahl 等人 2000. J. Cell Biol. 149:263），这使得该系统难以应用于治疗体内疾病。
视网膜色素变性是一种视网膜退行性疾病，表现为夜盲症，视野和周边视力进行性丧失，最终导致完全失明；检眼镜改变可包括深色马赛克视网膜色素沉着、视网膜血管衰弱、视盘蜡样苍白和晚期黄斑变性。在某些情况下，可能会出现色素紊乱。这种疾病是遗传性的，视网膜感光细胞的退化伴随着视网膜脉络膜血管变窄和循环障碍。
糖尿病性视网膜病变是 1 型和 2 型糖尿病患者失明的主要原因，是一种糖尿病并发症，会导致视网膜内的血管受损。糖尿病视网膜病变可分为四个阶段：（1）轻度非增殖性视网膜病变，其中视网膜血管中出现微动脉瘤； (2) 中度非增殖性视网膜病变，其中一些供应视网膜的血管被阻塞； (3) 严重的非增殖性视网膜病变，其中许多通往视网膜的血管被阻塞，剥夺了视网膜多个区域的血液供应； (4)增生性视网膜病变，新的、异常的、薄壁的和脆弱的血管生长以向视网膜供血，但这些新血管会渗漏血液，导致严重的视力丧失和失明。出血可能不止一次发生，通常在睡眠期间发生。此外，在糖尿病性视网膜病变的任何阶段，液体都会渗漏到黄斑中心，导致黄斑水肿和视力模糊。大约 40% 到 45% 的被诊断患有糖尿病的美国人患有某种阶段的糖尿病性视网膜病变，大约一半的增生性视网膜病变患者还患有黄斑水肿。
Stargardt 病或黄斑眼底是一种遗传性黄斑变性疾病。大多数患有这种疾病的患者在青少年时期就出现双侧视力下降的主诉。首次出现时视力通常在 20/40 范围内，但通常会在 4 或 5 年内降至 20/100 水平。视力通常会逐渐下降，但会在 20 岁以后逐渐下降，可能下降到 20/200 水平或更差。患者总是有特征性的视网膜斑点，这些在生命早期可能占据黄斑区。随着疾病的进展，黄斑显示出萎缩，这与某些与年龄相关的黄斑变性病例没有什么不同。然而，这种程度的萎缩通常出现在十几岁或二十出头的时候。一些患者会出现脉络膜新生血管膜或视网膜下的血管，它们可能会渗漏或出血。没有已知的治疗方法可以延缓或阻止疾病的进展。
高血压性视网膜病变涉及由高血压引起的视网膜损伤，导致视网膜血管变窄和过度渗漏液体。视网膜损伤（视网膜病变）的程度分为 I 到 IV 级，I 组包括视网膜动脉的轻微狭窄； II 组包括与局灶性狭窄和动静脉切口区域相关的视网膜动脉狭窄； III 组包括在 I 组和 II 组中看到的异常，以及视网膜出血、硬性渗出和棉絮斑； IV 组高血压性视网膜病变包括 I 至 III 组中发现的异常以及视盘和黄斑肿胀，可导致视力下降。控制高血压（高血压）是治疗高血压性视网膜病变的唯一方法。部分 IV 级高血压性视网膜病变患者的视神经或黄斑有永久性损伤。当存在第 IV 组和有时第 III 组变化时，高血压性脉络膜病变通常与高血压性视网膜病变相关。在急性期，在视网膜色素上皮层可见黄色斑点。它们被称为 Elshnig 结节。它们在荧光素血管造影中呈高荧光，似乎继发于脉络膜毛细血管内的纤维蛋白样坏死，导致覆盖的视网膜色素上皮细胞受损。在严重的情况下，血浆从这些病灶中大量渗漏会导致浆液性视网膜脱离。数周后，这些斑点会变得色素沉着或脱色。当斑点线性出现时，它们被称为西格里斯特条纹。
闭塞性视网膜病变或视网膜静脉阻塞是仅次于糖尿病性视网膜病变的视网膜血管疾病导致视力丧失的第二大原因，包括分支静脉和中央静脉阻塞，其中从视网膜排出血液的部分循环系统被阻塞，这会导致背压 - 毛细血管压力增加、血管扩张、出血、肿胀（水肿）以及静脉分布中液体和其他血液成分的渗漏。视网膜中央静脉阻塞影响整个视网膜。静脉完全闭塞会导致大量出血和水肿，受影响的毛细血管可能会停止功能并闭塞（缺血或毛细血管无灌注）。视网膜静脉阻塞的并发症包括黄斑水肿、黄斑缺血（血流不足）和新生血管形成（新异常血管的生长）。当静脉分布累及黄斑部时，该处出现出血、渗出或渗漏，导致黄斑部水肿伴有视力模糊和部分视野丧失。疤痕组织可在视网膜表面形成，形成黄斑皱襞，或视网膜前膜可导致视力问题（视物变形）。当毛细血管明显阻塞时，异常血管会生长（新生血管）并渗入眼睛后部的上覆眼眶（玻璃体积血），导致视网膜脱离。视网膜中央静脉阻塞是位于视神经上的视网膜静脉阻塞；闭塞可以是非缺血性或缺血性的。一些视网膜中央静脉阻塞与显着的毛细血管阻塞或无灌注以及在眼睛前方虹膜上发生新血管形成的倾向（虹膜红肿）有关。由于排液管堵塞，这些眼睛会出现非常高的压力（新生血管性青光眼），并出现严重的视力丧失、疼痛和视力丧失。视网膜中央静脉阻塞可引起黄斑水肿和眼底新生血管，导致玻璃体积血和视网膜脱离。
Rho 家族 GTP 酶调节轴突的生长和再生。灭活 Rho 与肉毒杆菌C3外转移酶（以下简称C3）可刺激受损轴突的再生和萌发； C3是纯化的毒素肉毒杆菌（参见 Saito 等人，1995，FEBS Lett 371：105-109；Wilde 等人，2000. J. Biol. Chem. 275：16478）。 C3族化合物肉毒杆菌通过 ADP-核糖基化使 Rho 失活，从而充当 Rho 作用或功能的拮抗剂（Rho 拮抗剂）。
视网膜成分的退化可导致部分或完全失明。黄斑变性是眼睛中视网膜黄斑区域的变性。黄斑变性导致急性视力下降，并最终导致急性视力丧失。湿性黄斑变性与视网膜血管的异常生长有关，这会导致血液渗漏和光感受器细胞受损。
年龄相关性黄斑变性 (AMD) 是临床可识别的可导致失明的眼部疾病的集合。
黄斑变性是一组影响中央视网膜或黄斑的疾病。黄斑变性有两种基本类型：“湿性”和“干性”。在湿性黄斑变性中，新血管异常生长。这些新血管破裂并漏出液体，从而损坏中央视网膜。这种形式的黄斑变性通常与年龄有关。大约 90% 的黄斑变性病例是干性黄斑变性。视力丧失可能是由于称为玻璃膜疣的视网膜碎片堆积和感光细胞死亡所致。这个过程会导致视网膜变薄和干燥。
AMD 结果包括玻璃膜疣、视网膜色素上皮病症（包括色素结块和/或脱落）、视网膜色素上皮脱离、地图样萎缩、视网膜下新生血管形成和盘状瘢痕的存在。年龄相关性黄斑变性是目前无法治愈的失明的主要原因之一，尤其是在 55 岁以上的人群中。 65 岁及以上的人中约有四分之一显示出与年龄相关的黄斑病变的迹象，75 岁及以上的人中约有 7% 患有晚期黄斑变性并伴有视力丧失。
玻璃疣是眼科可见的、黄白色、半透明的布鲁赫膜的生长物或结节。布鲁赫膜位于视网膜和邻近的视网膜色素上皮层下方。随着年龄的增长，脂肪会积聚在布鲁赫膜中，并可能导致玻璃膜疣的形成。
玻璃疣有两种形式。一种形式包括坚硬、小（直径小于约 60 微米）的玻璃膜疣，其大小不会随着年龄的增长而增大，并且不会诱发黄斑变性。另一种形式包括柔软、大（直径大于约 63 微米）的玻璃膜疣，它会随着年龄的增长而扩大和融合。柔软、大的玻璃膜疣可诱发黄斑变性，并且在患有晚期黄斑变性的人的眼睛中很常见，至少在他们的另一只眼睛中是这样。
玻璃膜疣可以是来自视网膜不同层的代谢废物，例如B. 来自视网膜，视网膜色素上皮和脉络膜毛细血管。玻璃膜疣可以是黄色、白色、灰色、屈光和/或粉红色。玻璃膜疣可以是小的、中的或大的。玻璃疣的形状可以是规则的或不规则的、对称的或不对称的。患有玻璃膜玻璃膜疣且一只眼睛出现并发症的患者另一只眼睛可能不会出现并发症。并发症可包括选自由视网膜色素上皮萎缩、脉络膜新生血管形成、浆液性视网膜脱离和出血性视网膜脱离组成的组的一种或多种病症。玻璃膜疣会损害对比敏感度，降低眼睛的视力以允许人们在弱光下阅读或看到足够的细节以允许人们在夜间安全驾驶汽车。
并非所有这些表现都需要被视为存在 AMD，仅玻璃膜疣与视力丧失没有直接关系。检眼镜或照片可检测到的玻璃膜疣的数量随着年龄的增长而增加。大多数 AMD 的定义包括玻璃膜疣作为先决条件，因为玻璃膜疣与威胁视力的 AMD 病变有关，例如地图样萎缩、视网膜色素上皮脱离和视网膜下新生血管形成。
虽然黄斑变性的确切原因尚不清楚，但已经确定了促成因素。影响因素的共同结果是感光细胞和滋养感光细胞的视网膜下组织之间的干扰，包括位于感光细胞下方并支持感光细胞的视网膜色素上皮，以及位于感光细胞下方并支持感光细胞滋养的脉络膜。视网膜色素上皮。
视网膜和黄斑可能会受到自由基和单线态氧等氧化剂的氧化损伤，1个厄2个.黄斑含有多不饱和脂肪酸，暴露在光线下，包括可见光和近紫外光谱中的高能蓝光，可以光敏地将三线态氧转化为单线态氧，这是一种可以破坏多不饱和脂肪酸的氧化剂。黄斑中的 DNA、蛋白质、脂质和碳水化合物。由视网膜成分和氧化剂之间的氧化相互作用产生的反应产物可以在视网膜色素上皮细胞中积累并导致黄斑变性。某些抗氧化营养素可以通过分解过氧化氢而不形成自由基、淬灭活性单线态氧以及在自由基到达细胞靶点之前清除和淬灭自由基来减少自由基和活性氧的形成，从而降低发生黄斑变性的风险。
黄斑变性病理学可能涉及的另一个因素包括血清低密度脂蛋白 (LDL) 胆固醇浓度升高。低密度脂蛋白胆固醇可被氧化剂氧化，形成在动脉粥样硬化斑块中发现的氧化 LDL。这些氧化产物会在健康的视网膜色素上皮细胞中积累为沉积物，并导致功能组织坏死或死亡。低密度脂蛋白胆固醇还可以在视网膜和视网膜下组织的血管中形成动脉粥样硬化斑块，引起组织缺氧，导致新生血管形成。接受无对抗雌激素替代疗法的绝经后妇女患新生血管性年龄相关性黄斑变性的风险可能会降低。雌激素可以增加血液中高密度脂蛋白胆固醇 (HDL) 的含量，从而导致脂溶性抗氧化剂的运输和代谢发生变化，并限制氧化的低密度脂蛋白胆固醇在视网膜和视网膜下组织和血管中的积累.
晚期黄斑变性的促成和指示因素是黄斑中感光细胞下方的脉络膜组织的新生血管形成。健康成熟的眼部血管系统通常是静止的，处于体内平衡状态，在这种状态下，在新血管系统的发育过程中，血管生成的正负介质之间保持平衡。黄斑变性，特别是在其晚期阶段，其特征在于黄斑下方的脉络膜中新血管的病理性生长。视网膜下脉络膜中的血管生成血管可能会渗漏，影响视力并导致失明。
脉络膜中的血管生成可由细胞因子生长因子如碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF) 的存在诱导。视网膜细胞缺氧可诱导此类生长因子的表达，细胞碎片或视网膜色素上皮细胞中积聚的玻璃膜疣、视网膜和视网膜下组织的氧化损伤或氧化的低密度脂蛋白胆固醇沉积可诱导缺氧。
现有的视网膜和视网膜下血管内皮细胞可以通过细胞因子生长因子如 bFGF 与内皮细胞酪氨酸激酶介导的受体的相互作用而被激活。活化的内皮细胞可以增加细胞增殖并表达多种分子因子，例如整合素 αv乙3个，粘附分子和蛋白水解酶，使新开发的内皮细胞能够扩散到周围组织。新扩张的内皮细胞可以形成血管束并最终分化成成熟的血管。
目前，没有任何治疗方法可以使大多数 AMD 患者受益。没有任何疗法可以显着减缓黄斑变性的退行性进展，或者可以抑制或显着降低视网膜下新生血管形成和眼睛黄斑下脉络膜组织中新生血管组织增殖的速度。大多数实验性治疗针对湿性 AMD 并专门针对新血管形成。视网膜下新生血管膜的激光光凝术发生在 10% 至 15% 的受影响患者中，可能有益于发生急性、中心凹外脉络膜新生血管形成的黄斑变性患者。在干性 AMD 中，每天服用高剂量的抗氧化剂，例如维生素 C（500 毫克）、维生素 E（400 国际单位）、β-胡萝卜素（15 毫克）和氧化锌（80 毫克；高锌浓度特别出现在眼睛组织中视网膜、色素上皮和脉络膜）可能会略微降低一只眼睛中度玻璃膜疣、大玻璃膜疣或非中心地理萎缩或晚期黄斑变性患者的进展风险。
已经公开了许多用于将药物施用于眼睛，包括眼睛的后部区域的技术。例如，美国专利。 US 5,707,643 涉及一种可生物降解的巩膜塞，它通过巩膜上的切口插入玻璃体中。为了将药物输送到眼睛，塞子将药物输送到玻璃体液中以通过玻璃体液扩散来治疗视网膜。
另一种用于将药物施用于眼睛的技术公开于美国专利No. 5, 888, 883中。美国专利 5,443,505 公开了可以放置在眼睛无血管区域（例如睫状体）或手术诱导的无血管区域上方脉络膜上腔的植入物。另一个实施例涉及在无血管区域上形成部分厚度的巩膜瓣，在剩余的巩膜床上放置植入物，其中可选地具有孔，并且缝合瓣。药物可扩散至玻璃体和眼内结构。
另一种向眼睛给药的递送方法是直接注射。对于眼睛的后段，玻璃体内注射已被用于将药物输送到玻璃体中。在这方面，美国专利。美国专利5,632,984涉及多种药物眼内注射治疗黄斑变性。对于将药物施用于眼，药物优选作为微胶囊注射。眼睛后段的眼内注射可使药物扩散到整个玻璃体、视网膜、脉络膜和对侧巩膜。此外，美国专利。美国专利 5,770,589 涉及通过玻璃体内注射抗炎剂到玻璃体内以将药物递送至眼睛来治疗黄斑变性。可以通过睫状体进行注射，以最大限度地减少对眼睛的伤害，同时将药物输送到眼后段。
另一种分娩方法是手术。例如，美国专利。美国专利 5,767,079 涉及通过施用 TGF-β 治疗眼科疾病，包括黄斑裂孔和黄斑变性，例如通过将有效量的生长因子应用于眼科异常。在黄斑和视网膜的治疗中，为了向眼睛给药，在可以直接应用生长因子之前进行涉及核心玻璃体切除术或全睫状体玻璃体切除术的外科手术，大概是通过前部巩膜给药无血管区域的眼睛部分或通过玻璃体、视网膜和脉络膜手术输送到视网膜后面的巩膜，这是一种戏剧性的、高度侵入性的技术，通常只适用于已经发生部分视力丧失或即将受到威胁的情况。
将药物输送到眼睛的另一种输送方法是使用装置和插管。例如，美国专利。美国专利 5,273,530 涉及视网膜内样本递送和收集及其设备。与直接眼内注射技术相比，该专利中公开的方法避免使用睫状体切口，而是使用围绕眼眶外部的插入路径。该装置具有弯曲的手柄和带领的尖端，允许插入套管穿过后巩膜并向下进入视网膜下腔，而无需穿过玻璃体液。项圈旨在将渗透调节到所需的深度。该装置被教导可调节到眼睛的任何部分，包括巩膜区域、脉络膜区域、视网膜下区域、视网膜区域和玻璃体区域。
将药物递送至眼睛的另一种递送方法是巩膜内注射。例如，美国专利。美国专利 6,397,849（其内容通过引用整体并入本文）公开了一种用于巩膜内注射的方法，包括通过覆盖视网膜组织的巩膜外表面上的位点将有效量注射到眼睛的巩膜层中治疗或诊断材料。取决于注射条件，材料可在巩膜层内形成贮存库并扩散到下层组织层如脉络膜和/或视网膜中，和/或材料可被迫穿过巩膜层并进入下层。因为巩膜随着整个眼睛（包括视网膜）移动，巩膜上的沉积部位相对于下方视网膜上的一个点保持不变，即使眼睛在眼眶内移动，以允许通过沉积的特定部位脱落巩膜中覆盖黄斑的位置处的材料，允许将材料输送到黄斑和周围组织。注射程序使用插管或针头和无针头颗粒/溶液技术。在优选实施例中，插管以相对于眼睛的旋转方向插入巩膜中，而不是垂直于巩膜表面。
用于将药物递送至眼睛的另一种递送方法公开于美国专利No. 5, 888, 87中。美国专利 6,299,895 公开了一种将生物活性分子递送至眼睛的方法，包括在眼球筋膜下腔内植入胶囊，该胶囊包含含有生物活性分子细胞源的核和周围的生物相容性壳，外壳允许生物活性分子扩散到眼睛中，生物活性分子的递送剂量在每名患者每天每只眼睛50pg和1000ng之间。生物活性分子可以是抗血管生成因子，并且第二生物活性分子或肽可以从胶囊共同递送至眼睛。公开了该方法可用于治疗包括黄斑变性在内的眼部疾病。
可与本发明的组合物一起使用的将药物施用于眼的其他递送方法在本领域中是众所周知的。例如，美国专利。美国专利 5,399,163 公开了一种通过对流体灌浆加压来提供射流注入的方法；美国专利。美国专利5,383,851公开了一种无针注射器；美国专利。美国专利5,312,335公开了一种无针注射系统；美国专利。 US 5,064,413公开了一种注射装置；美国专利。美国专利4,941,880公开了一种用于无创注射药物的安瓿；美国专利。美国专利4,790,824公开了一种无创皮下注射装置；美国专利。美国专利 4,596,556 公开了一种压力驱动的皮下注射器；美国专利。美国专利 4,487,603 公开了一种用于以受控速率输送药物的植入式微型输液泵；美国专利。美国专利 4,486,194 公开了一种用于透皮给药的治疗装置；美国专利。美国专利4,447,233公开了一种药物输液泵，用于以精确的输液速度输送药物；美国专利。美国专利4,447,224公开了一种用于连续给药的植入式可变流量输液装置；美国专利。美国专利 4,439,196 公开了一种多室渗透药物递送系统；和美国专利。美国专利 4,475,196 公开了一种渗透药物递送系统。
根据本发明，提供了一种包含治疗活性剂的缀合物、药物递送构建体或融合蛋白，该活性剂能够被递送穿过细胞壁膜，其中缀合物或融合蛋白包含至少一个转运亚结构域) 或部分（即载体区域）以及药物部分（即药物区域）。特别地，如本文所讨论的，根据本发明，提供了缀合物或融合蛋白，其中治疗活性剂是能够促进轴突（或树突或神经突）长出（例如，再生）的活性剂。（用于缓解） d． H。缀合的Rho拮抗剂形式的缀合物或融合蛋白。
本发明还涉及治疗哺乳动物宿主眼中与视网膜下新生血管形成和新生血管组织增生相关的黄斑变性的方法，以及抑制或显着降低与黄斑变性相关的眼中视网膜下新生血管形成和新生血管组织增殖速率的方法，以及可用于其中的药物组合物，其包含可渗透细胞的融合蛋白缀合物，所述融合蛋白缀合物包含细胞膜转运蛋白多肽和具有ADP-核糖基转移酶活性的试剂。
本发明还涉及治疗糖尿病性神经病变的方法，特别是与糖尿病引起的血管损伤相关的糖尿病性视网膜病变导致眼黄斑水肿和新生血管形成的方法，以及抑制或显着降低血管损伤和新生血管增生率的方法。与糖尿病性神经病相关的眼睛和可用于其中的药物组合物，其包含可渗透细胞的融合蛋白缀合物，所述融合蛋白缀合物包含多肽细胞膜转运剂和具有ADP-核糖基转移酶活性的试剂
本发明还涉及治疗视网膜色素变性的方法，这是一组与视网膜神经元，特别是光感受器神经元（也称为光感受器细胞）退化相关的遗传性视网膜疾病，以及抑制哺乳动物眼中光感受器退化的方法宿主，以及抑制或显着降低与色素性视网膜炎相关的光感受器细胞死亡率的方法，以及可用于其中的药物组合物，其包含细胞可渗透的融合蛋白缀合物，所述融合蛋白缀合物包含多肽细胞膜转运剂和具有ADP-核糖基转移酶的活性剂活动。
具体而言，本发明涉及用于细胞内递送 C3 蛋白（例如 C3 本身或其他活性类似物，例如 C3 样转移酶 - 见下文）或其他 Rho 拮抗剂以修复神经系统损伤以防止缺血性细胞死亡的试剂预防和治疗需要灭活 Rho 的各种疾病。递送剂可以采用嵌合（即共轭）C3 样 Rho 拮抗剂的形式。这些共轭拮抗剂比 C3 化合物（单独）有显着改善，因为它们在抑制性底物上刺激轴突生长的效力比单独的重组 C3 高 3 到 4 个数量级。这些 Rho 拮抗剂的例子已作为重组蛋白生产，旨在促进细胞膜穿透（即增强拮抗剂的细胞摄取），在应用于神经元以刺激生长抑制底物上的生长时改善剂量反应，并使 Rho 失活。这些缀合的 Rho 拮抗剂的实例在下文中关于名称 C3APL、C3APLT、C3APS、C3-TL、C3-TS、C3Basic1、C3Basic2 和 C3Basic3 进行了描述。
本发明在其一个方面提供药物递送构建体或缀合物[例如， [能够抑制中枢神经系统（CNS）损伤部位或周围神经系统（PNS）损伤部位处的神经元轴突生长]，包含至少一个转运剂区域和与药物区域相关的非天然药物区域，其中转运剂区域能够促进（即促进）药物区域摄取到哺乳动物（即人或动物）组织或细胞中，并且其中药物区域是活性治疗药物区域能够（即，能力或具有促进轴突生长的能力，例如在生长抑制底物上（例如再生），无论是在体内（在哺乳动物（例如人或动物）中）还是在体外（在细胞培养物中），包括其衍生物或同系物（即其药学上可接受的化学等价物-药学上可接受的衍生物或同系物）。
根据本发明，活性剂区域可以是ADP-核糖基转移酶C3区域。根据本发明，ADP-核糖基转移酶C3可以选自ADP-核糖基转移酶(例如ADP-核糖基转移酶C3)，其来源于肉毒杆菌和重组ADP-核糖基转移酶（例如重组ADP-核糖基转移酶C3）编码整个C3编码区或仅C3编码区的一部分（片段）保留ADP-核糖基转移酶活性，或类似物（保留ADP的C3衍生物） -核糖基转移酶活性或足够的 C3 编码区能够有效地使 Rho 失活。该药物也可以选自其他已知的作用于 Rho 的 ADP-核糖基转移酶 (Wilde et al. 2000 J. Biol. Chem. 275-16478-16483; Wilde et al. 2001. J. Biol. Chem. 276:9537 -9542 ).
在另一方面，本发明提供了一种药物偶联物，其由共价连接至活性货物部分（例如，通过肽键或不稳定键（即，在靶细胞的内部环境中容易裂解或发生化学变化的键），其中转运多肽部分能够或具有将活性货物单元吸收到哺乳动物（例如人类或动物）组织或细胞（例如 HIV 的转运子域（例如 HIV-1）Tat 蛋白、同源蛋白转运序列（也称为转运同源蛋白）（例如 Antennapedia 同源域）、组氨酸标签（长度范围从4 至 30 个组氨酸重复序列）或其变体衍生物或同系物（即其药学上可接受的化学等价物））[通过受体非依赖性方法]并且其中活性货物实体是能够（即H。具有促进轴突生长（例如再生、出芽）或神经保护（防止细胞死亡）的能力或能力）在体内（在哺乳动物（例如人或动物）中）或体外（在细胞中）。（即促进).文化）。
根据本发明，转运多肽部分可选自由以下组成的组：SEQ ID NO.：48，HIV(例如HIV-1)的Tat蛋白的转运亚结构域，例如SEQ ID NO.：46， SEQ ID NO.：47，来自 Antennapedia 的同源域，例如 SEQ ID NO.：44，SEQ ID NO.：45，组氨酸标签及其功能衍生物和类似物（例如 SEQ ID NO.：21，SEQ ID NO. : 26, SEQ ID NO: 31) [即H。通过添加多胺或任何富含碱性氨基酸的随机序列] - [即H。 [其药学上可接受的化学等价物]，并且其中活性货物部分选自能够（即具有容量或能力）轴突生长（例如再生、出芽）或神经保护（预防细胞死亡）的 C3 蛋白。体内（哺乳动物（例如，人或动物））或体外（细胞培养）。
根据本发明，C3蛋白可以选自ADP-核糖基转移酶C3和ADP-核糖基转移酶C3类似物。根据本发明，ADP-核糖基转移酶C3可以选自ADP-核糖基转移酶(例如ADP-核糖基转移酶C3)，其来源于肉毒杆菌和重组ADP-核糖基转移酶（例如，重组ADP-核糖基转移酶C3）。 ADP-核糖基转移酶可以是具有 C3 样活性的蛋白质，例如金黄色葡萄球菌(Wilde et al. 2001. J. Biol. Chem. 276: 9537-9542)。 ADP-核糖基转移酶可以是用于使 RhoA、RhoB 和/或 RhoC 失活的任何其他转移酶，例如梭菌， 和蜡样芽孢杆菌(Wilde et al. 2000. J. Biol. Chem. 275:16478-16483)。根据本发明，转运多肽部分可以包括如本文所述的活性连续氨基酸序列。
另一方面，本发明提供了一种融合蛋白（多肽）[例如能够抑制中枢神经系统 (CNS) 损伤部位或周围神经系统 (PNS) 损伤部位的神经元轴突生长抑制到 (for)]，由羧基末端活性货物部分和氨基末端运输部分组成，其中氨基末端转运单元选自 HIV 的转运子域（例如 HIV-1）、Tat 蛋白、同源蛋白转运序列（也称为转运同源蛋白）（例如 Antennapedia 的同源域），a组氨酸标签及其功能衍生物和类似物（即其药学上可接受的化学等价物），其中活性货物部分由 C3 蛋白组成。
特别地，本发明提供了一种融合蛋白（多肽）（例如能够阻抑（for）抑制神经元轴突在中枢神经系统（CNS）损伤部位或外周神经系统（PNS）损伤部位的生长），其包含羧基末端活性货物部分和氨基末端转运部分的组合，其中氨基末端转运部分由天线足同源结构域组成，活性货物部分由 C3 蛋白（即如本文所述）组成。特别地，本发明还提供了一种融合蛋白（多肽）（例如能够抑制中枢神经系统（CNS）损伤部位或周围神经系统（PNS）损伤部位的神经元轴突生长的抑制），其由羧基-末端活性货物部分和氨基末端转运部分，其中氨基末端转运部分由（例如HIV-1)Tat蛋白的转运亚结构域组成，活性货物部分由C3蛋白（即如本文所述）组成。 .
根据本发明，C3蛋白可以选自ADP-核糖基转移酶C3和ADP-核糖基转移酶C3类似物。根据本发明，ADP-核糖基转移酶C3选自ADP-核糖基转移酶(例如ADP-核糖基转移酶C3)，其来源于肉毒杆菌和重组ADP-核糖基转移酶（例如，重组ADP-核糖基转移酶C3）。
另一方面，本发明提供了一种融合蛋白（多肽）[例如能够抑制神经元轴突在中枢神经系统（CNS）损伤部位或周围神经系统（PNS）损伤部位向（for）]的抑制，由氨基末端活性货物部分和羧基末端运输部分组成，其中羧基端转运部分选自HIV Tat蛋白的转运亚结构域、同源蛋白转运序列（也称为转运同源蛋白）（例如Antennapedia的同源结构域）、组氨酸标签和功能衍生物，和其类似物（即其药学上可接受的化学等价物），并且其中活性货物部分由 C3 蛋白组成。
特别地，本发明提供了一种融合蛋白（多肽）（例如能够阻抑（for）抑制神经元轴突在中枢神经系统（CNS）损伤部位或周围神经系统（PNS）损伤部位的生长），其包含氨基末端活性货物部分和羧基末端转运部分的组合，其中羧基末端转运部分由天线足同源结构域组成，活性货物部分由C3蛋白（即如本文所述）组成。
特别地，本发明还提供了一种融合蛋白（多肽）（例如能够抑制中枢神经系统（CNS）损伤部位或周围神经系统（PNS）损伤部位的神经元轴突生长的抑制），其由氨基-末端活性货物部分和羧基末端转运部分，其中羧基末端转运部分由HIV Tat蛋白的转运亚结构域组成，活性货物部分由C3蛋白组成（即如本文所述）。
根据本发明，C3蛋白可以选自ADP-核糖基转移酶C3和ADP-核糖基转移酶C3类似物。根据本发明，ADP-核糖基转移酶 C3 选自 ADP-核糖基转移酶 C3，其来源于肉毒杆菌和重组ADP-核糖基转移酶C3。
在另一方面，本发明提供了选自下组的成员的用途，该组由以下各项组成：如本文所述的药物递送构建体、如本文所述的药物偶联物和如本文所述的融合蛋白（多肽）（例如，包括药学上的用于抑制神经元轴突生长抑制的可接受的化学品及其等同物。
在另一方面，本发明涉及药物组合物（例如用于抑制神经元轴突生长抑制），该药物组合物包含药学上可接受的稀释剂或载体和有效量的活性成分，所述活性成分选自包含递送的药物如本文所述的构建体、如本文所述的药物偶联物和如本文所述的融合蛋白（多肽）（例如，包括其药学上可接受的化学等价物）。
本发明还提供了选自本文所述的药物递送构建体、本文所述的药物缀合物和本文所述的融合蛋白（多肽）（例如，包括其药学上可接受的化学等价物）的成员在用于药物组合物的制造（例如用于抑制神经元轴突生长的抑制）。
本发明还涉及用于制备包含如上所定义的缀合物或融合蛋白（多肽）的药物递送构建体的方法
在有利于药物递送构建体、偶联物或融合蛋白（多肽）在细胞内表达的条件下培养宿主细胞（细菌或真核细胞）； （药物递送构建体、缀合物或融合蛋白（多肽）也可以表达为在动物中产生，例如在农场动物奶中产生重组蛋白）和
通过纯化步骤回收药物递送构建体、偶联物或融合蛋白（多肽）。
药物递送构建体、缀合物或融合蛋白（多肽）的纯化可以通过亲和方法、离子交换层析、尺寸排阻层析、疏水性或通常用于蛋白质纯化的任何其他纯化技术来完成。优选地，纯化步骤将在非变性条件下进行。另一方面，如果需要变性步骤，可以使用本领域已知的技术使蛋白质复性。
本发明还涉及药物递送构建体、缀合物或融合蛋白（多肽）在哺乳动物细胞中的表达，当与信号序列一起使用时，允许融合蛋白表达和分泌到细胞外环境中。其他表达系统（酵母细胞、细菌细胞、昆虫细胞等）可能适合于表达（产生）如本文所讨论的本发明的药物递送构建体、缀合物或融合蛋白（多肽）。
特别地，本发明提供了一种融合蛋白(多肽)，其选自C3APL(SEQ ID NO.：4)、C3APLT(SEQ ID NO.：37)、C3APS(SEQ ID NO.：6)、C3 - TL（序列号：14）、C3-TS（序列号：18）、C3Basic1（序列号：25）、C3Basic2（序列号：30）、C3Basic3（序列号： 35）。 ), SEQ ID NO.: 20 和 SEQ ID NO.: 43 及其药学上可接受的化学等价物。
根据另一方面，本发明提供药物组合物，其包含选自下组的多肽：C3APL(SEQ ID NO.：4)、C3APLT(SEQ ID NO.：37)、C3APS(SEQ ID NO.：37) ), 6), C3-TL (序列号: 14), C3-TS (序列号: 18), C3Basic1 (序列号: 25), C3Basic2 (序列号: 30), C3Basic3 (SEQ ID NO.：35)、SEQ ID NO.：20 和 SEQ ID NO.：43，以及药学上可接受的载体。
根据本发明，药物组合物还可以包含生物胶，例如纤维蛋白(fibrin glue)。
另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含包含至少一个(一个或多个)转运剂区域和药物区域的多肽，其中药物区域选自由ADP-核糖基转移酶C3和ADP-核糖基转移酶组成的组C3类似物和药学上可接受的载体。
根据本发明，转运蛋白区域可以位于多肽的羧基末端，而活性中心区域可以位于多肽的氨基末端。
根据本发明，药物组合物还可以包含生物胶，例如纤维蛋白(fibrin glue)。
另一方面，本发明提供了包含至少一个（一个或多个）转运剂区域和药物区域的多肽，其中药物区域选自ADP-核糖基转移酶C3和ADP-核糖基转移酶C3类似物（其中转运剂区域能够促进药物区域摄入细胞（细胞内或细胞膜内）。
另一方面，本发明提供了一种由羧基末端药物部分和氨基末端转运部分区域组成的多肽（其中转运剂区域能够促进药物区域摄取到（细胞内）或细胞膜）和其中羧基端药物残基可选自ADP-核糖基转移酶C3及其ADP-核糖基转移酶C3类似物。
根据本发明，羧基末端转运残基区域可以选自富含碱性氨基酸的区域和富含脯氨酸的区域。
另一方面，本发明涉及由氨基末端药物部分和羧基末端转运部分区域组成的多肽，其中氨基末端药物部分可选自ADP-核糖基转移酶C3和ADP-核糖基转移酶 C3 类似物。
根据本发明，羧基末端转运残基区域可以选自富含碱性氨基酸的区域和富含脯氨酸的区域。
在另一方面，本发明涉及包含至少一个转运剂区域(包括一个、两个、三个或更多个转运剂区域)和药物区域的缀合物，其中药物区域选自ADP-核糖基转移酶 C3 和 ADP-核糖基转移酶 C3 类似物，其中转运区与活性中心区共价连接。
根据本发明，转运剂区域可以与活性剂区域（本发明的C3样蛋白及其类似物）交联（例如化学交联、UV交联）。
根据本发明，转运蛋白区域可以根据重组DNA技术与ADP-核糖基转移酶C3和ADP-核糖基转移酶C3类似物融合（例如克隆转运蛋白区域的DNA序列与ADP-核糖基转移酶C3的DNA序列符合读框）或 ADP-核糖基转移酶 C3 类似物，其可能包括也可能不包括间隔 DNA 序列（多克隆位点、接头）或在表达后不会影响 C3 样蛋白活性的任何其他 DNA 序列）。
在另一方面，本发明涉及选自以下的多肽的用途：C3APL(SEQ ID NO.：4)、C3APLT(SEQ ID NO.：37)、C3APS(SEQ ID NO.：6) , C3-TL (SEQ ID NO.: 14), C3-TS (SEQ ID NO.: 18), C3Basic1 (SEQ ID NO.: 25), C3Basic2 (SEQ ID NO.: 30), C3Basic3 (SEQ ID NO.: 30) .: 30). .:35), SEQ ID NO.: 20 和 SEQ ID NO.: 43, 用于制造药物组合物。
在其他方面，本发明涉及包含至少一个（一个或多个）转运剂区域和药物区域的多肽用于制造药物组合物或用于促进（促进）轴突生长或用于治疗（在治疗）神经损伤（例如，由创伤性神经损伤或疾病引起的神经损伤引起的神经损伤）或预防（减少、抑制（部分或完全））细胞凋亡（细胞死亡，例如中枢神经系统缺血）或抑制（减少）神经元轴突生长的抑制或治疗与中风相关的缺血性损伤或抑制（减少）Rho 活性或再生（帮助再生）受伤的轴突（帮助受伤的轴突恢复部分或全部功能）或周围神经元帮助（帮助）与哺乳动物（例如神经细胞）中的其他（周围）细胞（神经元细胞）建立新的联系（发育轴突、树突、神经突）。 ，人，动物），其中药物区域选自ADP-核糖基转移酶C3和ADP-核糖基转移酶C3类似物。
包含与具有ADP-核糖基转移酶活性的药物共价连接的多肽细胞膜转运蛋白的细胞渗透性融合蛋白缀合物可用于治疗选自由黄斑变性（湿性AMD和干性AMD）组成的组的眼部疾病。），色素性视网膜炎、斯塔加特氏病、糖尿病性视网膜病、高血压性视网膜病和闭塞性视网膜病以及相关的视网膜疾病。细胞渗透性融合蛋白-Rho 拮抗剂有望防止新血管形成和光感受器细胞死亡，这与仅针对疾病中存在的新血管形成的其他治疗方法不同。这对于治疗湿性黄斑变性特别有益。
一方面，治疗有效量的药物组合物包含可渗透细胞的融合蛋白缀合物，所述融合蛋白缀合物包含细胞膜转运蛋白多肽和肉毒杆菌C3外转移酶部分或其功能类似物，例如融合蛋白，如C3APLT，可表现出抗血管生成活性并可用于治疗选自黄斑变性、色素性视网膜炎、斯塔加特病的眼病，糖尿病性视网膜病变、高血压性视网膜病变和闭塞性视网膜病变。治疗有效量可为每毫升约1微克至每毫升约10微克，或每毫升约10微克至约50微克。
本发明的药物组合物的施用可以选自关节内、眼内、鼻内、神经内、皮内、骨内、舌下、口服、局部、膀胱内、鞘内、静脉内、腹膜内、颅内、肌肉内、皮下、吸入，雾化和吸入，直接应用于组织或眼睛或中枢神经系统的近端，直接应用于疾病部位，特别是向视网膜供血的血管或眼睛的细胞或组织或结构，直接应用于或进入手术切除后剩余的边缘，例如B.肿瘤切除，肠内，肠内结合胃镜手术和ECRP。
本发明的药物组合物的施用优选通过注射进行，例如通过注射到眼睛中，优选地注射到向眼睛供血的血管中，或者通过首先穿透巩膜显微注射到黄斑中，通过局部施用，例如作为眼组织，例如角膜或巩膜，或通过植入，例如通过从储库或植入物中控制释放，包含本发明的融合蛋白，任选地存在药学上可接受的基质或载体，该储库或植入物靠近眼睛组织，优选靠近或嵌入构成眼睛后部的组织。可以将治疗有效量的本发明的融合蛋白递送到靠近眼睛黄斑的脉络膜和视网膜，以防止（例如在预防性治疗中）或延缓导致黄斑变性的血管生长。眼睛。
一方面，本发明的治疗组合物可以通过多种技术施用于眼部，包括通过使用本领域已知的医疗装置和施药方法，例如美国专利No. 5, 777, 33中描述的那些。第 6,397,849 号； 6,299,895； 5,770,589； 5,767,079； 5,707,643； 5,632,984； 5,443,505； 5,399,163； 5,383,851； 5,273,530； 5,064,413； 4,941,880； 4,790,824； 4,596,556； 4,487,603； 4,486,194； 4,475,196； 4,447,224； 4,447,233；和上文引用的 4,439,196，这些专利通过引用并入本文。许多其他递送方法，例如包含本发明蛋白质的水溶性差和/或可生物降解的控释基质组合物的单一或多重植入物、可生物降解并包含药物的可植入水凝胶基质、可注射递送系统例如作为脂质体悬浮液，包含包埋在脂质体的内部和/或膜部分内的本发明的蛋白质，脂质体悬浮在水性介质中，注射方法例如包括无针注射器或插管或针和注射器，纳米颗粒植入包含本发明的蛋白质和难溶于水且可生物降解的载体的方法，以及适用于将药物递送至眼睛和向眼睛供血的血管的给药途径可以与本发明的组合物一起使用。
可以通过多种技术将本发明的融合蛋白和融合蛋白的药物组合物递送至眼睛的黄斑区，优选递送至接近黄斑的眼后段。这种技术的例子是：
- a) 无菌的、药学上可接受的、可生物降解的巩膜塞的用途，其包含本发明的融合蛋白和任选的药学上可接受的、可生物降解的基质，例如聚乳酸或聚乙醇酸或乳酸和乙醇酸的共聚物，其中塞子可以是通过巩膜切口引入眼睛；
- b)包含本发明的融合蛋白和任选的药学上可接受的生物可降解基质的植入物的用途，其中切割巩膜以暴露脉络膜上腔并且其中将植入物置于脉络膜上腔腔模具中，融合蛋白释放到其中，用于例如眼睛的玻璃体区域；
- c)玻璃体内注射包含本发明的融合蛋白和无菌水性载体的药物组合物的用途，其中所述融合蛋白包含亚微米至约4微米大小的药学上可接受的微粒组合物；
- d) 通过柔性插管注射或输注，该插管可穿过巩膜后部并向下进入眼睛后部的视网膜下腔；和
- e)通过将包含本发明的融合蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物注射到巩膜的无血管区域以在巩膜层内形成包含本发明的融合蛋白的储库并且融合蛋白可以从该储库扩散到黄斑、脉络膜层和/或视网膜。
一方面，本发明的药物组合物可包含选自聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)、PVA、部分水解的聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)的药学上可接受的载体。 co-醋酸乙烯酯), co-醋酸乙烯酯-co-乙烯醇), 交联聚(乙烯-co-醋酸乙烯酯), 交联部分水解聚(乙烯-co-醋酸乙烯酯), 交联聚(乙烯-co-醋酸乙烯酯) -乙酸乙烯酯-co-乙烯醇）。），聚-D，L-乳酸，聚-L-乳酸，聚乙醇酸，PGA，乳酸和乙醇酸的共聚物，聚己内酯，聚戊内酯，聚（酸酐），聚己内酯与聚乙二醇的共聚物、聚乳酸与聚乙二醇的共聚物、聚乙二醇；纤维蛋白、明胶泡沫（这是一种水不溶性、灰白色、非弹性、多孔、柔韧的凝胶泡沫，由纯化的明胶如猪皮明胶和注射用水制成），及其组合和混合物。共聚物可包含按重量计约1％至约99％的第一单体单元，例如环氧乙烷，和按重量计99％至约1％的第二单体单元，例如环氧丙烷。第一种聚合物如明胶和第二种聚合物如聚-L-乳酸或聚乙醇酸的共混物可占第一种聚合物重量的约 1% 至约 99% 和约 99% 至约1重量％的第一聚合物和第二聚合物。
本发明的融合蛋白可以制备为在水性介质中的溶液或悬浮液，例如注射用水中的缓冲盐水或磷酸盐溶液，灭菌，例如通过0.2微米或更小孔径的过滤器过滤，将B.注射到可被完全吸收的无菌凝胶泡沫（Gelfoam）基质中。这种吸收取决于几个因素，包括使用量、血液或其他液体的饱和度以及应用部位。例如，当放置在软组织中时，明胶海绵可以在四到六周内完全吸收，而不会引起过多的疤痕组织。适用于流血的鼻腔、直肠或阴道粘膜，可在两到五天内液化。
另一方面，本发明的药物组合物包含药学上可接受的载体。例如，载体可以选自水、药学上可接受的缓冲盐、药学上可接受的缓冲溶液、药学上可接受的抗氧化剂例如抗坏血酸、一种或多种低分子量药学上可接受的多肽例如药学上可接受的包含约2至约10个氨基酸残基的肽、一种或多种药学上可接受的蛋白质如白蛋白、一种或多种药学上可接受的氨基酸如人类必需氨基酸、一种或多种药学上可接受的碳水化合物、一种或多种药学上可接受的乙酰化或者例如通过与具有2至20个碳原子的药学上可接受的羧酸、非还原糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、海藻糖、甘露糖醇、麦芽糖糊精、糊精、环糊精、药学上可接受的螯合剂酯化而获得的其他酯化碳水化合物材料B. EDTA，即乙二胺四乙酸，DTPA，二价金属离子如锌离子的螯合剂，三价金属离子螯合剂，谷胱甘肽，药学上可接受的非特异性血清白蛋白，生长因子抗体，以及组合其中。
本发明的药物组合物可以是无菌的、可灭菌的和灭菌的。优选的灭菌方法涉及在无菌环境中通过0.2微米过滤器过滤药物组合物。可以单位剂量体积（包含治疗有效量的本发明融合蛋白）或单位剂量的整数倍（例如，2单位剂量、3个单位剂量、4个单位剂量等），优选在惰性气氛如无菌氮气或氩气下，并且小瓶用药学上可接受的塞子密封，任选地用卷边盖。在另一个方面，药物组合物通过除去水来干燥，例如，可以通过诸如冻干或蒸发的干燥过程从每个小瓶中除去水性介质以产生包含本发明的融合蛋白的干燥或脱水的基质，留下加盖和加盖小瓶。在另一方面，载体可以包含药学上可接受的基质形成材料或与融合蛋白相容的赋形剂(例如药学上可接受的非还原性碳水化合物)以及本发明的化合物或融合蛋白的无菌或可灭菌的高渗溶液，其中可将高渗溶液置于小瓶中并干燥（例如，通过冻干）以提供包含融合蛋白和基质形成赋形剂的基质，其可在小瓶中加盖。可以在使用前例如通过无菌注射器或插管将无菌水加入小瓶中，使水溶解基质以提供融合蛋白的溶液或悬浮液。可以加入足量的水以提供作为适合可注射或可植入用途的等渗溶液的重构溶液或混悬液。
本文提供的药物组合物可以与包装材料一起放置在容器中，包装材料提供关于使用此类材料的说明。通常，此类说明包括对活性成分浓度的描述，并且在某些实施例中，还包括赋形剂或稀释剂（例如，水、盐水或 PBS）的相对量或特性。此外，可能需要通过加入水并任选地通过摇动或超声将药物组合物重构为药学上可接受的溶液或悬浮液。
治疗有效量的本发明的药物组合物（例如，以喷雾剂或气雾剂的形式）可以通过内窥镜程序施用，其中将组合物喷雾或雾化到患者体内以提供包含融合物的涂层包含在患者体内组织上的本发明的蛋白质。在另一个方面，将药物组合物施用于眼睛近端且优选接近眼睛脉络膜的组织可以抑制涂有药物组合物的组织区域中的血管生成。
任选地，药物组合物可以包装在小瓶或注射器中用于注射。小瓶或注射器可包含单位剂量的冻干形式的药物组合物或融合蛋白，其可通过添加水例如注射用水再水化。任选地，小瓶可以含有两个或更多个，例如三个或四个或五个单位剂量的融合蛋白或其药物组合物。任选地，药物组合物可以被冻干。优选地，药物组合物是在惰性或非氧化性或基本上无氧的气体或气氛如氮气、氩气、二氧化碳或碳氟化合物或碳氟化合物气体存在下制备的。
优选地，本发明的药学上可接受的溶液与血液基本等渗。
一方面，融合蛋白在基本上不溶于水的气体如碳氟化合物如全氟丙烷的存在下和任选地在药学上可接受的表面活性剂如磷脂或含聚环氧乙烷的表面活性剂如Pluronic F68或F108，并经受诸如超声振动或快速摇动的振动，其中获得包含融合蛋白和气体的微泡，优选地具有小于约2微米的平均直径，该微泡可以通过显微注射被注射到血管中向眼睛供应血液以将治疗有效量的融合蛋白递送至靠近黄斑的冠状动脉和视网膜。
可用于治疗选自黄斑变性、色素性视网膜炎、斯塔加特氏病、糖尿病性视网膜病、高血压性视网膜病和闭塞性视网膜病的眼病的本发明的组合物可以配制成多种形式。例如，在一个实施方案中，一种药物组合物包含治疗有效量的可渗透细胞的融合蛋白缀合物，所述融合蛋白缀合物包含细胞膜转运蛋白多肽和肉毒杆菌C3外转移酶部分或其功能类似物可包含微球，其中融合蛋白与包含药学上可接受的聚合物载体的基质混合或包埋在基质中，任选地在水的存在下（混合物含有约0.1%至约50%的本发明的融合蛋白，在一个实施方案中；可选地，包含本发明的融合蛋白和聚合载体的微球可以悬浮在无菌的、药学上可接受的水性介质中，其优选地与血液等渗，在另一个实施方案中）可接受的缓冲盐、药学可接受的表面活性剂、药学可接受的碳水化合物、药学可接受的润肤剂等。
在另一个实施方案中，本发明的药物组合物可包含治疗有效量的可渗透细胞的融合蛋白缀合物，其包含细胞膜转运蛋白多肽和肉毒杆菌C3外转移酶部分或其功能类似物可以包括糊剂、乳膏、软膏、悬浮液，例如在药学上可接受的油如药学上可接受的甘油三酯等中。
在另一个实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的可渗透细胞的融合蛋白缀合物，所述融合蛋白缀合物包含细胞膜转运蛋白多肽和肉毒杆菌C3外转移酶部分或其功能类似物可包含膜，例如其中融合蛋白任选地通过体内注射混合或与药学上可接受的载体混合或混合，例如水性明胶或水性蛋白质或聚合物载体或其组合靠近眼睛或靠近眼睛的血管，任选地存在能够交联载体的药学上可接受的交联物质。在一个实施例中，可以注射该混合物。或者，可以将混合物涂成薄膜或层压板，任选地在薄膜基底或载体或基质的存在下，并任选地通过加热或冷冻干燥来干燥或脱水。薄膜可以单位剂量形式制备，也可以散装并分割和切割成单位剂量形式。
在另一个实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的可渗透细胞的融合蛋白缀合物，所述融合蛋白缀合物包含细胞膜转运蛋白多肽和肉毒杆菌C3外转移酶部分或其功能类似物可包含气溶胶或可喷雾或可雾化的组合物，例如融合蛋白在微球中的悬浮液或溶液，其包含本发明的融合蛋白和聚合载体，可悬浮在无菌药物组合物中在另一个实施方案中，优选与血液等渗的水性介质）、药学上可接受的缓冲盐、药学上可接受的表面活性剂、药学上可接受的碳水化合物、药学上可接受的润肤剂等。
在另一个实施方案中，本发明的药物组合物可包含治疗有效量的可渗透细胞的融合蛋白缀合物，其包含细胞膜转运蛋白多肽和肉毒杆菌C3外转移酶部分或其功能类似物可以包括糊剂、乳膏、软膏、悬浮液，例如在药学上可接受的油如药学上可接受的甘油三酯等中。
在另一个实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的可渗透细胞的融合蛋白缀合物，所述融合蛋白缀合物包含细胞膜转运蛋白多肽和肉毒杆菌C3外转移酶部分或其功能类似物可包含膜，例如其中融合蛋白任选地通过体内注射混合或与药学上可接受的载体混合或混合，例如水性明胶或水性蛋白质或聚合物载体或其组合靠近眼睛或靠近眼睛的血管，任选地存在能够交联载体的药学上可接受的交联物质。在一个实施例中，可以注射该混合物。或者，可以将混合物涂成薄膜或层压板，任选地在薄膜基底或载体或基质的存在下，并任选地通过加热或冷冻干燥来干燥或脱水。薄膜可以单位剂量形式制备，也可以散装并分割和切割成单位剂量形式。
在另一个实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的可渗透细胞的融合蛋白缀合物，所述融合蛋白缀合物包含细胞膜转运蛋白多肽和肉毒杆菌C3外转移酶部分或其功能类似物可包含气雾剂或可喷雾或可雾化的组合物，例如融合蛋白在药学上可接受的液体中的悬浮液或溶液，例如缓冲液的水溶液，任选地具有张力调节剂；在药学上可接受的流体中，例如超临界或液化气体，例如二氧化碳或丙烷或碳氟化合物或低分子量碳氟化合物或氟溴碳化合物或氯氟烃等，每种气体在 37°C 和环境压力下，组合物，例如适合用作气雾剂。气溶胶可用于将本发明的融合蛋白递送至靠近眼睛的组织表面或进入眼睛组织。
在另一个方面，本发明的组合物可以被配制为含有多种额外的化合物以提供具有特定物理性质（例如，熔点，例如约30°C，如通过使用聚乙二醇，或特定的释放速率，这可能与基质中的交联度或水合速率有关，或与基质的增溶有关，或与基质中可在基质中留下孔隙的组分的优先增溶有关基质，载体液体，例如水，可以通过该基质帮助将融合蛋白从基质中转运到所需部位，例如哺乳动物体内靠近眼睛的组织或眼睛的一部分。
药物分子的化学修饰可导致药物分子在体液（例如血液）和体内组织中的半衰期增加，这就是聚乙二醇化。 PEG化涉及将一个或多个含PEG的基团共价连接至药物分子，例如蛋白质或肽药物分子。 PEG 有时被称为聚（乙二醇）或聚氧乙烯或聚乙二醇。含 PEG 的基团有时称为“PEG”基团或“MPEG”基团，其中 PEG 指的是羟基封端的聚乙二醇或ω-羟基-PEG 或 HO-PEG，而 MPEG- 相关.指甲氧基封端的聚(乙二醇)或ω-甲氧基-PEG-或-CH-3个O-PEG 或 MeO-PEG。有用的PEG和MPEG平均分子量通常为约1000道尔顿至约20,000道尔顿或更多，优选约2000至约20,000道尔顿，更优选约5000至约20,000道尔顿。聚乙二醇化可以通过将活化的 PEG 或 MPEG 基团（例如，末端被化学反应性官能团取代的 MPEG）连接到药物分子上的化学反应性位点（例如，赖氨酸的ε-氨基进入肽或蛋白质、肽或蛋白质的末端氨基、巯基等）在合适的介质如缓冲水溶液中。含PEG试剂上的化学反应性官能团的实例包括PEG或MPEG的α-活性酯，例如α-N-羟基琥珀酰胺基PEG或MPEG酯、α-对硝基苯基PEG或-MPEG酯，乙烯基砜基、氯三嗪基等。活性官能团通常通过共价连接的间隔基团与 PEG 基团分开，例如通过第一个共价键（例如，通过活性酯基团与胺反应形成的酰胺键；通过形成的硫醚键）通过巯基与碘甲基羰基反应生成 PEG 或 MPEG 基团，并通过第二个共价键与化学反应性官能团反应。有用的间隔基的实例包括琥珀酸酯间隔基、亚甲基羰基、亚乙基羰基、三嗪基、亚乙基磺酰基等。有用的聚乙二醇化试剂，包括低二醇聚乙二醇化试剂，可从例如阿拉巴马州亨茨维尔的 Nektar Therapeutics 商购获得。美国专利号 5,672,662，其公开内容通过引用并入本文。聚乙二醇化通常与药物剂量减少和毒性降低有关）并且在某些情况下可能会干扰聚乙二醇化产生的免疫反应。聚乙二醇化被认为通过改变分子的大小并通过空间位阻改变与其他分子（例如抗体）的相互作用来起作用。聚乙二醇化已被证明对一些治疗性酶、肽和抗体有效。
本发明的 PEG 化融合蛋白的一个有用的实施方案可以具有共价连接（例如通过酰胺键s)或硫醚键连接至本发明的融合蛋白，其中PEG化融合蛋白中转运剂部分的细胞渗透性范围为约1%至约100%（例如，10%、20%、25未PEG化的融合蛋白中转运剂的细胞通透性的%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、80%、95%、99%，其中PEG化融合蛋白的ADP-核糖基转移酶活性范围为约1%至约100% (例如，10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80当在相同的参考实验条件下比较聚乙二醇化融合蛋白和相应的非聚乙二醇化融合蛋白的性质时，非聚乙二醇化融合蛋白的ADP-核糖基转移酶活性的％、80％、95％、99％。
在本发明的某些实施方案中，可以组合组合物以实现期望的效果（例如，两种或更多种组合物，例如第一种微球组合物，含有一定量（例如，按重量计15%）的该融合蛋白。发明）。在明胶基质中连同 0.1% 的交联剂如琥珀醛和第二微球组合物，其包含在明胶基质中一定量（例如 25% 重量）的本发明的融合蛋白以及约 2% 的交联剂例如琥珀醛可以组合以获得本发明融合蛋白的改进的净释放速率，例如快速释放和缓慢或延长释放。
一方面，快速释放可包括在小于约8小时内释放组合物中约50％的融合蛋白。另一方面，缓慢或持续释放可包括在约2周内释放约50％量的融合蛋白。
在本发明的其他方面，本发明的药物组合物可以应用于可植入装置的表面，例如无菌手术网、金属丝、支架、假体装置等，以形成包含融合物的涂层装置本发明的蛋白质和任选的载体，例如聚合物载体，其中涂层装置可以植入患者的组织或器官中，例如眼睛近端的组织或眼睛的一部分，或植入供给血液的血管中作为手术治疗的一部分，将血液输送到眼睛，其中药物组合物以能够预防或抑制或延缓或延缓靠近装置部位的新生血管形成的治疗有效量递送，例如延迟靠近装置部位的新生血管形成设备的黄斑。
在另一个方面，治疗有效量的融合蛋白可以防止或抑制或延缓或延迟远离植入装置部位的黄斑近端血管的生长。
融合蛋白的浓度可为在装置上形成涂层的支持物的重量的0.01％至约20％，并且涂层的厚度可为约20微米至约1毫米。可以通过涂装设备领域中已知的涂装方式施加涂层。例如，包含本发明的药物组合物的涂层可以通过喷雾或气溶胶涂药器施加到装置的表面，其中药物组合物作为溶液或悬浮液存在于液体或包含溶剂的流体 一种液体或流体，可以在作为喷雾剂或气雾剂使用期间和之后蒸发、喷洒或雾化到装置的表面上。任选地，涂层组合物可以包含反应性化学官能团，例如烯烃或酸酐基团或活性酯或迈克尔反应受体，例如与羰基共轭的碳-碳双键，其中双键可以与胺或蛋白肽反应或明胶，如载体蛋白，其反应性化学官能团可以在支持物中以化学或光化学方式形成交联，从而防止溶解或限制、修改或控制溶胀（取决于反应性官能团数量的浓度或暴露时间）交联条件，例如植入装置的血管组织中的含水流体对涂层载体的涂层装置的紫外线或伽马辐射。控制肿胀可用于控制治疗有效量的本发明融合蛋白从装置迁移到装置近端组织并进一步进入患者体内的速率。本领域已知的多种交联化学可用于本发明的该方面，只要融合蛋白的生物活性不被否定或消除。当在涂层过程中使用有机溶剂或超临界流体或液化气体时，可选择药学上可接受的载体，其不易溶解在植入部位近端组织中存在的水性介质中，但允许治疗性药物渗透活性剂允许在水性介质中存在一定量的融合蛋白。
可以使用其他涂覆装置的方法，例如浸涂组合物、涂漆、幕涂和层压本发明的药物组合物。在一个实施方案中，装置的表面可以首先涂有第一涂层或胶层，例如明胶或聚乙烯醇，随后任选交联，然后涂有本发明的药物组合物作为第二涂层.可以选择底漆层以使其粘附到金属或聚合物装置的表面并粘附到第二外涂层的支持物，例如明胶。底漆层还可以包括固定的化学官能团（例如，其可以连接到底漆层中的聚合物）并且可以与第二层形成交联键。底漆层可以任选地包含相对移动的分子，例如包含两个或更多个反应性官能团，例如二醛，例如琥珀醛，这些分子可以迁移到第二层中并与其中的化学官能团反应以形成交联分子桥。
或者，可将药学上可接受的第三层包被到装置的第二层上，任选地其中第三层不含本发明的融合蛋白。第三层（例如明胶层）可用于控制或改变融合蛋白从装置中释放的速率，例如通过能够溶解或膨胀或通过增加其对水或融合蛋白的渗透性作为功能将包含本发明药物组合物的第二层暴露于来自组织的水性介质的时间。
在本发明的一个实施方案中，可以使用或植入患者体内，例如在患者眼睛的手术过程中，使用或植入包含本发明的药物组合物的外科网状装置，所述药物组合物施加到金属丝或聚合物网状物的表面。带涂层的网状装置可以释放治疗有效量的药物组合物的活性成分（例如 C3APLT 或其活性突变体或截短形式），足以防止黄斑近端和植入部位近端的布鲁赫膜中的新血管形成。涂层设备。融合蛋白可以以足以在接近装置的组织中提供治疗有效浓度范围的速率从装置迁移。
目前优选的浓度范围是从每立方厘米(cc)组织约0.0001微克融合蛋白到每立方厘米(cc)组织约100微克可能是有用的。目前更优选的治疗有效浓度范围是约0.001微克/cc至约50微克/cc组织。
在本发明的一个实施方案中，融合蛋白可以具有约240,000道尔顿至约300,000道尔顿的分子量。
本发明的另一个方面包括本发明的药物组合物在成套试剂盒中，例如包含容器和本发明的药物组合物的试剂盒；包含密封小瓶和本发明药物组合物的试剂盒；包含无菌注射器和本发明的药物组合物的试剂盒；包含含有本发明药物组合物的无菌注射器的试剂盒；包含喷雾器或气溶胶施用器和本发明的药物组合物的试剂盒；包含刷涂器和本发明的药物组合物的试剂盒；包含针头和本发明的药物组合物的试剂盒；包含粉末涂药器和本发明的药物组合物的试剂盒（其中粉末涂药器可用于通过将干燥的（例如冻干的）粉末局部施用到组织上来将本发明的药物剂型作为粉末给药，试剂盒 一种组合物，包含带涂层的可植入装置和本发明的药物组合物，其中给药是通过植入进行的。
根据本发明，转运剂区域可以位于多肽（即蛋白质）的氨基末端，ADP-核糖基转移酶 C3 或 ADP-核糖基转移酶-C3 类似物可以位于多肽（即蛋白质）的羧基末端。 ， 蛋白质）。
根据本发明，转运剂区域可以位于多肽（即蛋白质）的羧基末端，ADP-核糖基转移酶 C3 或 ADP-核糖基转移酶 C3 类似物可以位于多肽（即蛋白质）的氨基末端。蛋白质）。
在另一方面，本发明提供抑制神经元轴突生长抑制的方法（例如，在哺乳动物（例如，人、动物）中），包括施用（例如，递送）选自药物递送构建体的成员、药物偶联物、融合蛋白和多肽（例如，包括其药学上可接受的化学等价物），其中多肽具有至少一个（一个或多个）转运剂区域和选自由ADP-核糖基转移酶组成的组的药物区域C3和ADP-核糖基转移酶C3类似物（直接）在（患者的）中枢神经系统（CNS）损伤部位或周围神经系统（PNS）损伤部位，其量有效抵消所述抑制。这种应用可用于治疗多种周围神经病，例如糖尿病性神经病。
例如，本发明提供包含C3酶的重组Rho拮抗剂，所述C3酶具有碱性氨基酸段（例如，富含碱性氨基酸的区域）或添加至C3编码序列的富含脯氨酸的区域以允许它们并入组织或细胞中用于修复和/或促进修复或促进中枢神经系统的生长，即使在没有外伤性轴突损伤的情况下。下面给出了富含碱性氨基酸的区域和富含脯氨酸的区域的例子。
在另一方面，本发明提供了一种促进轴突长出（例如在哺乳动物（例如人、动物）中）的方法，包括递送包含至少一个转运剂区域和选自下组的药物-药物区域的多肽或缀合物由 ADP-核糖基转移酶 C3 和 ADP-核糖基转移酶 C3 类似物组成，以有效促进生长的量直接作用于中枢神经系统 (CNS) 损伤部位或周围神经系统 (PNS) 损伤部位。
在另外的方面，本发明提供了一种用于（用于）治疗神经损伤（例如在哺乳动物（例如人、动物）中）的方法，包括递送包含至少一个转运蛋白区域和选自以下的活性剂区域的多肽或缀合物组由 ADP-核糖基转移酶 C3 和 ADP-核糖基转移酶 C3 类似物组成，直接位于（至）中枢神经系统（CNS）病变部位或周围神经系统（PNS）病变部位。
在又一个方面，本发明提供了一种防止细胞凋亡（例如，在哺乳动物（例如，人、动物）中）的方法，包括递送包含至少一个转运蛋白区域和选自以下的药物-药物区域的多肽或缀合物该组由直接位于中枢神经系统 (CNS) 病变部位或周围神经系统 (PNS) 病变部位的 ADP-核糖基转移酶 C3 和 ADP-核糖基转移酶 C3 类似物组成。
另一方面，本发明提供了一种治疗与中风相关的局部缺血性损伤的方法（例如，在哺乳动物（例如，人、动物）中），包括递送包含至少一个转运剂区域和一个药物区域的多肽或缀合物来自直接在中枢神经系统 (CNS) 损伤部位（对于哺乳动物）的 ADP-核糖基转移酶 C3 和 ADP-核糖基转移酶 C3 类似物。
在又一方面，本发明提供了一种抑制 Rho 活性的方法，包括将包含至少一个转运蛋白区和一个活性中心区的多肽或缀合物直接递送至中枢神经系统 (CNS) 损伤部位或周围神经系统 (PNS) 损伤部位，有效抑制活性的量。
根据另一方面，本发明提供了一种用于再生受损轴突（例如在哺乳动物（例如人、动物）中）的方法，包括递送包含至少一个转运剂区域和选自下组的药物区域的多肽或缀合物由 ADP-核糖基转移酶 C3 和 ADP-核糖基转移酶 C3 类似物组成，直接作用于中枢神经系统 (CNS) 损伤部位或周围神经系统 (PNS) 损伤部位（例如在哺乳动物中），有效量可使受伤的轴突再生。
根据进一步的方面，本发明提供了用于（用于）帮助神经元建立新的细胞连接（轴突、树突、神经突与其他（周围）细胞（神经元细胞）的发育）的方法，包括递送多肽或缀合物，其包含在至少一个转运剂区域和一个药物区域选自由ADP-核糖基转移酶C3和ADP-核糖基转移酶C3类似物直接位于中枢神经系统(CNS)损伤部位或周围神经系统(PNS)损伤部位。
在另一方面，本发明提供了一种用于产生包含至少一个（一个或多个）转运蛋白区和活性中心区的多肽的方法，其中该转运蛋白区可以选自由以下组成的组：SEQ ID NO.：21 ，SEQ ID NO.：26，SEQ ID NO.：31，SEQ ID NO.：44，SEQ ID NO.：45，SEQ ID NO.：46，SEQ ID NO.：47，SEQ ID NO.：48 和其类似物，并且其中药物区域可以选自由ADP-核糖基转移酶C3和ADP-核糖基转移酶C3类似物组成的组，该方法包括：
- a)在有利于多肽在细胞内表达的条件下培养宿主细胞；和
- b)通过纯化步骤回收多肽。
根据本发明，多肽的纯化可以通过亲和法、离子交换层析、尺寸排阻层析、疏水性或通常用于蛋白质纯化的任何其他纯化技术来完成。优选地，纯化步骤将在非变性条件下进行。另一方面，如果需要变性步骤，可以使用本领域已知的技术使蛋白质复性。
另一方面，本发明提供了一种由富含碱性氨基酸的区域和活性剂区域组成的多肽，其中来自富含碱性氨基酸的区域的氨基酸包括选自组氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸的氨基酸。和精氨酸，其中药物结构域是ADP-核糖基转移酶C3。
在又一方面，本发明涉及包含至少一个转运剂区域和一个药物区域的多肽的用途，其中药物区域选自由ADP-核糖基转移酶C3和ADP-核糖基转移酶C3类似物组成的组用于制造用于抑制神经元轴突生长抑制的药物（或药物组合物）。
根据本发明，所述多肽可以选自C3APL(SEQ ID NO.：4)、C3APL(SEQ ID NO.：37)、C3APS(SEQ ID NO.：6)、C3-TL( SEQ ID NO.：14)、C3-TS(SEQ ID NO.：18)、C3Basic1(SEQ ID NO.：25)、C3Basic2(SEQ ID NO.：30)、C3Basic3(SEQ ID NO.：35)， SEQ ID NO.：20 和 SEQ ID NO.：43。
另一方面，本发明涉及包含至少一个转运剂区域和一个药物区域的多肽的用途，其中药物区域选自ADP-核糖基转移酶C3和ADP-核糖基转移酶C3类似物，用于制造药物（或药物组合物）以促进轴突生长。
根据本发明，所述多肽可以选自C3APL(SEQ ID NO.：4)、C3APLT(SEQ ID NO.：37)、C3APS(SEQ ID NO.：6)、C3-TL( SEQ ID NO.：14)、C3-TS(SEQ ID NO.：18)、C3Basic1(SEQ ID NO.：25)、C3Basic2(SEQ ID NO.：30)、C3Basic3(SEQ ID NO.：35)， SEQ ID NO.：20 和 SEQ ID NO.：43。
在另一方面，本发明涉及包含至少一个（一个或多个）转运剂区域和药物区域的多肽的用途，其中药物区域选自ADP-核糖基转移酶C3和ADP-核糖基转移酶 C3 类似物，用于制造治疗神经损伤（例如在哺乳动物（例如人、动物）中）的药物（或药物组合物）。
根据本发明，所述多肽可以选自C3APL(SEQ ID NO.：4)、C3APLT(SEQ ID NO.：37)、C3APS(SEQ ID NO.：6)、C3-TL( SEQ ID NO.：14)、C3-TS(SEQ ID NO.：18)、C3Basic1(SEQ ID NO.：25)、C3Basic2(SEQ ID NO.：30)、C3Basic3(SEQ ID NO.：35)， SEQ ID NO.：20 和 SEQ ID NO.：43。
根据本发明，本文讨论的转运剂区域可以选自富含碱性氨基酸的区域（包含碱性氨基酸（例如，精氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酰胺和/或天冬酰胺）的区域））和富含脯氨酸的区域（例如，包含脯氨酸的区域）。
根据本发明，本文讨论的富含碱性氨基酸的区域可选自由以下组成的组：SEQ ID NO.：48，HIV Tat 蛋白的一个亚结构域（例如 SEQ ID NO.：46，SEQ ID NO.48）。 ：47，或 Tat 的任何其他可作为运输序列的子结构域），来自 Antennapedia 的同源结构域（例如，SEQ ID NO.：44、SEQ ID NO.：45，或来自 Antennapedia 的任何其他结构域，可作为转运序列）转运序列）、同源蛋白转运序列、组氨酸标签及其类似物（例如，SEQ ID NO.：21、SEQ ID NO.：26、SEQ ID NO.：31）。
根据本发明，本文讨论的碱性氨基酸区域可以选自 SEQ ID NO.: 21 (Basic 1)、SEQ ID NO.: 26 (Basic2)、SEQ ID NO.: 31 (Basic3 ), SEQ ID NO.: 44 (APL), SEQ ID NO.: 45 (APS) SEQ ID NO.: 46 (TL), SEQ ID NO.: 47 (TS) 及其类似物。
根据本发明，本文讨论的富含脯氨酸的区域可以选自由SEQ ID NO.：48(APLT)及其类似物组成的组。
在另一个方面，本发明提供了一种分离的多核苷酸，其至少包含选自以下的多核苷酸序列（例如本文公开的多核苷酸序列，另外具有（或在某些情况下没有）合适的（DNA）主链（例如质粒、病毒载体））由以下组成的组：SEQ ID NO.：3，SEQ ID NO.：5，SEQ ID NO.：13，SEQ ID NO.：17，SEQ ID NO.：19，SEQ ID NO.：24，SEQ ID NO：29 ，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：36 和 SEQ ID NO：42。
在又一方面，本发明提供了用至少包含多核苷酸序列（例如除了（或在在某些情况下没有）选自下组的合适主链（例如质粒、病毒载体）：SEQ ID NO.：3、SEQ ID NO.：5、SEQ ID NO.：13、SEQ ID NO.：17、SEQ ID NO.：19，SEQ ID NO.：24，SEQ ID NO.：29，SEQ ID NO.：34，SEQ ID NO.：36 和 SEQ ID NO.：42。
在进一步的方面，本发明提供了一种由货物单元和运输单元组合组成的递送装置，其中该运输单元选自由SEQ ID NO：48及其类似物组成的组。 SEQ ID NO：48及其类似物充当促进细胞膜穿透的转运部分。连接（例如连接）到 SEQ ID NO:48 或其一些类似物的任何货物实体（例如蛋白质、化学品）都包括在本发明中。例如，SEQ ID NO: 48 及其类似物可以连接到抗癌剂、治疗剂、凋亡剂、抗凋亡剂、报告蛋白、抗体、抗体片段、染料、探针、标记等。一方面，细胞膜转运单位多肽包括含有约5至约50个氨基酸的肽。
根据本发明，货物部分可以在转运部分依赖性细胞内递送后保留生物活性。生物学活性可以包括例如生物学特性（例如酶活性）及其免疫学特性。货物部分可以对细胞有直接的生物学作用，例如在细胞内化后杀死细胞，也可以有间接的生物学作用，例如，货物部分可以是一种前药，它本身是无活性的，但在修饰后变得有活性（例如裂解、磷酸化等）或当第二个分子被引入细胞时。货物实体也可以是生物非活性（即惰性）化合物，例如标记分子（例如化学品、蛋白质）、成像分子等。
根据本发明，试剂可以是融合蛋白，其具有作为货物部分的氨基末端和作为运输部分的羧基末端。
根据本发明，货物实体可以选自分析分子（例如组织培养实验中使用的分子、标签、探针、染料、报告蛋白）、治疗分子（例如毒素、药物、前药）、预防分子分子和诊断分子（即用于体内或体外检测特定病症、代谢物或其他分子的分子）。分析分子、治疗分子、预防分子和诊断分子的实例包括蛋白质（例如，酶（例如，核酸酶、蛋白酶、激酶等）、细胞因子、趋化因子、抗原、抗体、抗体片段、报道蛋白（例如辣根过氧化物酶） 、β-半乳糖苷酶、荧光蛋白（例如绿色荧光蛋白））、核酸、多糖、染料、同位素（例如放射性同位素）、标记物、探针和其他类型的化学品。本发明的转运多肽可以有利地通过化学交联或通过基因融合连接至货物分子。
根据本发明，货物实体可以选自ADP-核糖基转移酶C3及其ADP-核糖基转移酶C3类似物。
另一方面，本发明涉及SEQ ID NO：48所示的多肽及其类似物。
在又一个方面，本发明提供了如 SEQ ID NO:48 所示的多肽及其类似物，其中该多肽和类似物可能能够充当载体，用于细胞内递送选自以下的货物试剂：由分析分子、治疗分子、预防分子和诊断分子组成的组。
根据本发明，负载剂可以选自ADP-核糖基转移酶C3及其ADP-核糖基转移酶C3类似物。
当货物单元与 SEQ ID NO:48 及其类似物连接（例如基因融合、化学交联等）时，可以促进（增强）货物单元跨细胞膜的运输（细胞内递送）。因此，本发明的一个目的是提供一种用于细胞内递送货物单元的方法，该方法包括将细胞暴露于包括货物单元和运输单元的递送工具，其中运输单元选自由 SEQ ID NO:48 及其类似物组成，其中运输实体允许递送剂在细胞内递送（即，穿过细胞膜）。可以跨细胞膜运输的货物实体的一个例子是 ADP-核糖基转移酶 C3 及其类似物。货物单元的其他示例在本文中提及。该方法还包括以足以允许摄取递送剂的方式（例如，浓度）将包含货物实体和运输实体（SEQ ID NO:48及其类似物）的递送剂引入靶细胞的环境中，从而能够通过细胞。例如，在体外（例如，细胞培养物）递送的情况下，递送剂（在药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂等中）可以直接添加到细胞外环境（例如，细胞培养基）中贴壁细胞（即细胞系或原代细胞）或悬浮细胞。或者，可以在与递送剂接触之前收获和浓缩细胞。细胞内递送可以通过本领域已知的技术监测，例如免疫荧光、免疫组织化学，或通过货物实体的内在特性（例如，其酶活性）。
体内给药(在哺乳动物中)可以例如通过将给药剂(在药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、纤维蛋白凝胶等中)输注到组织、神经损伤部位、开放性伤口等来进行.)本发明的足以促进货物单元的生物效应（例如，受伤组织的恢复、愈合等）的量。此外，体内给药可以通过本领域已知的其他方法进行，例如通过肌内(IM)、皮下(SC)、皮内(ID)、静脉内(IV)或静脉内(IV)注射进行注射。使用适当的方法，通过腹膜 (IP) 途径或给药至粘膜，包括口腔和鼻腔的粘膜。或者，可以从哺乳动物分离细胞并在重新注入同一个体或相容个体之前用本发明的递送剂离体处理（暴露）（例如，在基因治疗技术中）。
本文所用的术语“Rho拮抗剂”包括但不限于（已知的）C3，包括嵌合C3蛋白和类似的Rho拮抗剂。
术语“C3 蛋白”是指从中分离出 C3 的 ADP-核糖基转移酶肉毒杆菌或重组 ADP-核糖基转移酶。
本文所用的术语“C3样蛋白”、“ADP-核糖基转移酶C3样蛋白”、“ADP-核糖基转移酶C3类似物”、“C3样转移酶”或“嵌合C3蛋白”是指任何一种蛋白(多肽)具有与ADP-核糖基转移酶C3相似（例如相同、基本相似）的生物活性。此类C3样蛋白的实例包括但不限于C3APL、C3APLT、C3APS、C3-TL、C3-TS、C3Basic1、C3Basic2和C3Basic3以及SEQ ID NO：20中定义的蛋白。
术语“神经损伤部位”是指外伤性神经损伤或疾病引起的神经损伤部位。神经损伤部位可以是单个神经（例如，坐骨神经）或由许多神经组成的神经束（例如，脊髓的受损区域）。神经损伤部位可能在中枢神经系统，也可能在周围神经系统，或任何需要修复的区域。中风引起的损伤可能会形成神经损伤部位。由于手术、脑肿瘤切除或癌症损伤后的治疗，神经损伤部位可能在大脑中。神经损伤部位可能由中风、帕金森病、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症 (ALS)、糖尿病或任何其他类型的神经退行性疾病引起。
术语“货物”是指运输实体以外的分子，其 (1) 本身不能进入细胞（例如，细胞室），或（2）本身不能侵入细胞（例如，细胞室) 以低廉的价格。本文使用的术语“货物”是指分子本身，即。 H。在缀合之前，或在转运多肽-货物缀合物的货物部分上。 “货物”的例子包括但不限于小分子和大分子，例如多肽、核酸（多核苷酸）、多糖和化学品。
如本文所用，术语“递送代理”是指包括货运单元和运输单元的代理。货物部分的例子在上面讨论过，包括，例如，ADP-核糖基转移酶 C3 和 ADP-核糖基转移酶 C3 类似物。运输单位的例子包括，例如，SEQ ID NO：48及其类似物。
“多核苷酸”泛指任何多核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸，可以是未修饰的RNA或DNA，也可以是修饰的RNA或DNA。 “多核苷酸”包括但不限于单链和双链 DNA、单链和双链区域混合的 DNA、单链和双链 RNA 以及单链和双链区域混合的 RNA、含有 DNA 和可以是单链或更典型地双链或单链和双链区域的混合物的RNA。此外，“多核苷酸”是指包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区域。术语多核苷酸还包括含有一个或多个修饰碱基的DNA或RNA以及具有出于稳定性或其他原因修饰的主链的DNA或RNA。 “修饰的”碱基包括例如三苯甲基化的碱基和不寻常的碱基如肌苷。对 DNA 和 RNA 进行了多种修饰；因此，“多核苷酸”包括通常在自然界中发现的多核苷酸的化学、酶促或代谢修饰形式，以及病毒和细胞特有的 DNA 和 RNA 的化学形式。 “多核苷酸”包括但不限于线性和末端分子。 “多核苷酸”还包括相对较短的多核苷酸，通常称为寡核苷酸。
“多肽”是指由两个或多个通过肽键或修饰的肽键（即，肽电子等排物）连接的氨基酸组成的任何肽或蛋白质。 “多肽”是指通常称为肽、寡肽或寡聚体的短链和通常称为蛋白质的较长链。如上所述，多肽可以含有除20个基因编码的氨基酸之外的氨基酸。
本文所用的术语“类似物”是指突变体、变体、嵌合体、融合、缺失、添加和相对于给定多肽进行的任何其他类型的修饰。术语“类似物”与同系物、衍生物和化学或生物等效物同义。
如本文所用，术语“同源”序列是指源自C3APL、C3APLT、C3APS、C3-TL、C3-TS、C3Basic1、C3Basic2和C3Basic3的DNA序列或多肽序列的核苷酸或氨基酸序列。
如本文所用，术语“异源”序列是指异源多肽的 DNA 序列或氨基酸序列，包括除 C3APL、C3APLT、C3APS、C3-TL、C3-TS、C3Basic1、C3Basic2 和C3基础3。
如本文所用，术语“富含碱性氨基酸的区域”是指具有高含量碱性氨基酸如精氨酸、组氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸(Lys)的蛋白质区域。例如，“富含碱性氨基酸的区域”可能具有 15% 或更多（高达 100%）的碱性氨基酸。在某些情况下，“富含碱性氨基酸的区域”的碱性氨基酸含量可能低于 15%，但仍可作为转运蛋白区域发挥作用。更优选地，碱性氨基酸区域具有30％或更多(最多100％)碱性氨基酸。
如本文所用，术语“富含脯氨酸的区域”指在其序列中具有5%或更多（高达100%）脯氨酸的蛋白质区域。在某些情况下，“富含脯氨酸的区域”的脯氨酸含量在 5% 到 15% 之间。此外，“富含脯氨酸的区域”是指包含比在天然存在的蛋白质（例如，由人类基因组编码的蛋白质）中通常观察到的更多的脯氨酸的蛋白质区域。本发明的“富含脯氨酸的区域”起到转运剂区域的作用。
术语“富含脯氨酸的区域”还可以指在包含肽或蛋白质的分子内通过肽酰胺键连接的10个氨基酸的任何线性序列，其中线性序列中的10个氨基酸中至少有3个是脯氨酸残基，每个脯氨酸在其氮原子处共价连接一个肽酰胺键，并在其羧基（羰基）位点共价连接另一个肽酰胺键。肽内任何 10 个氨基酸序列中的富含脯氨酸的区域可包含 2 个或更多个脯氨酸残基和 8 个或更少的非脯氨酸氨基酸。例如，在一方面，包含10个氨基酸序列的肽中富含脯氨酸的区域，在包含10个或更多氨基酸的肽内，包含2个脯氨酸残基和8个非脯氨酸氨基酸残基，以任意组合分布在10种氨基酸。在另一个方面，包含10个氨基酸序列的肽中富含脯氨酸的区域，在包含10个或更多个氨基酸的肽内，包含3个脯氨酸残基和7个非脯氨酸氨基酸残基的任何组合，在10个氨基酸分布。在另一方面，包含10个氨基酸序列的肽中富含脯氨酸的区域，在包含10个或更多个氨基酸的肽内，包含4个脯氨酸残基和6个非脯氨酸氨基酸残基，其以任何组合对应于分布有10个氨基酸。在另一个方面，包含10个氨基酸序列的肽中富含脯氨酸的区域，在包含10个或更多个氨基酸的肽内，包含5个脯氨酸残基和5个非脯氨酸氨基酸残基，10个氨基酸之间的任意组合酸分布。在另一个方面，包含10个氨基酸序列的肽中富含脯氨酸的区域，在包含10个或更多氨基酸的肽内，包含6个脯氨酸残基和4个非脯氨酸氨基酸残基的任意组合，在10个氨基酸分布。在另一个方面，包含10个氨基酸序列的肽中富含脯氨酸的区域，在包含10个或更多个氨基酸的肽内，包含7个脯氨酸残基和3个非脯氨酸氨基酸残基的任何组合，在10个氨基酸分布。在另一个方面，包含10个氨基酸序列的肽中富含脯氨酸的区域，在包含10个或更多个氨基酸的肽内，包含8个脯氨酸残基和2个非脯氨酸氨基酸残基的任何组合，在10个氨基酸分布。在另一方面，包含10个氨基酸序列的肽中富含脯氨酸的区域，在包含10个或更多个氨基酸的肽内，包含9个脯氨酸残基和1个非脯氨酸氨基酸残基，其对应于10个氨基酸以任意组合分布。另一方面，包含10个氨基酸序列的肽中富含脯氨酸的区域可包含包含10个或更多氨基酸的肽内的10个脯氨酸残基。
在另一个方面，“富含脯氨酸的区域”是指蛋白质的氨基酸序列区域，其含有比通常在天然存在的蛋白质（例如，由人类基因组编码的蛋白质）中观察到的更多的脯氨酸。
本发明组合物中肽的“富含脯氨酸区”可用于增加本发明融合蛋白穿过细胞膜的转运速率。
肽或蛋白质的非富含脯氨酸的区域可包含通过肽键共价连接的10个氨基酸的序列，该区域含有零个或一个脯氨酸残基。
本发明组合物的细胞膜转运增强肽可包含一个或多于一个富含脯氨酸的区域，每个区域可以是相同或不同的氨基酸序列，并且每个区域由肽共价连接-键或通过肽键，包含一个或多个非脯氨酸氨基酸序列，当非脯氨酸氨基酸序列包含多于10个氨基酸时，每个非脯氨酸氨基酸序列可以相同或不同。
在本发明的一个方面，优选的组合物包含细胞可渗透的融合蛋白偶联物，其包含富含脯氨酸的多肽细胞膜转运部分，该部分包含附接至氨基酸的C末端区域的富含脯氨酸的氨基酸序列。肉毒杆菌融合蛋白缀合物中的 C3 外转移酶部分或其功能类似物。特别优选的组合物是命名为C3APLT的融合蛋白。在本发明的另一个方面，优选的组合物包含细胞可渗透的融合蛋白缀合物，其包含富含脯氨酸的多肽细胞膜转运部分，其包含连接至氨基酸的N端区域的富含脯氨酸的氨基酸序列。肉毒杆菌融合蛋白缀合物中的 C3 外转移酶部分或其功能类似物。融合蛋白组合物，其包含附着于肉毒杆菌C3外转移酶部分或其功能类似物有时在本文中称为C3APLT的类似物或变体。
功能性融合蛋白类似物肉毒杆菌C3外转移酶部分可包含多肽，例如融合蛋白（例如C3APLT）的生物活性氨基酸序列改变的片段和类似物，其中C3APLT的这种氨基酸序列改变的片段和类似物的生物活性起因于基本上类似于以下的作用机制C3APLT 的那个。这样的片段可以包括或包括相对于C3APLT中的那些具有一个或多个氨基酸截短的氨基酸序列。此类片段包含或包含相对于 C3APLT 中的氨基酸序列截短（或消除）一个或多个氨基酸的氨基酸序列，其中截短可以来自氨基或 N-末端、来自羧基-或 C-末端，或来自蛋白质序列的内部。融合蛋白的类似物和变体例如本发明的C3APLT可以包括一个或多个氨基酸的插入或取代。
包含可用于本发明的片段、类似物和变体的本发明的组合物具有能够通过ADP-核糖基化使Rho GTP酶失活的C3APLT和C3的生物学特性。优选地，本发明的融合蛋白能够使多于一种的Rho GTP酶失活。优选地，本发明的融合蛋白对Rho GTP酶的ADP-核糖基化的活性范围是Rho GTP酶的活性的0.5至10倍。肉毒杆菌C3 在灭活 Rho GTPase 中的活性更优选为 0.5 至 100 倍肉毒杆菌C3 使 Rho GTPase 失活，最优选是活性的 0.8 到 1000 倍肉毒杆菌C3 参与 Rho GTPase 的失活。
关于通过 ADP 核糖基化使 Rho-GTP 酶失活，活性由 Glu 的存在提供173在里面休息肉毒杆菌C3胞外酶存在于本发明的融合蛋白中。优选地，本发明的融合蛋白的氨基酸序列包含Glu173氨基酸残基肉毒杆菌本发明的C3胞外酶和融合蛋白表现出ADP核糖基化活性的0.5至10倍范围内的ADP核糖基化活性肉毒杆菌C3，更优选0.5至100倍的ADP核糖基化活性肉毒杆菌C3，最优选是 ADP 核糖基化活性的 0.8 至 1000 倍肉毒杆菌C3。结构的具体部分肉毒杆菌必须保守以保留 ADP-核糖基化活性的 C3 可以在 Saito 等人, FEBS Letters, 371:105-109, 1995 中找到，其全部内容通过引用并入本文。
如本文所用，术语“帮助神经元与其他细胞建立新的连接”或“帮助神经元与其他细胞建立新的连接”是指当用药物递送构建体（例如融合蛋白）处理细胞（例如，神经元）或组织时、本发明的多肽或药物组合物、神经元可以例如B. 新的树突、新的轴突或新的轴突（即细胞芽）或先前存在的树突、轴突或神经元生长（发育）。神经突（即细胞芽）被诱导更大程度地生长。
如本文所用，术语“载体”是指自主复制的DNA或RNA分子，外来DNA或RNA片段插入其中，然后在宿主细胞中用于表达或扩增外来DNA或RNA分子进行繁殖。术语“载体”包括但不限于可用于将DNA序列从一种生物体转移至另一种生物体的质粒（例如线性化或非线性化）。
术语“药学上可接受的载体”或“赋形剂”和“生理学上可接受的载体”等应理解为是指可接受的载体或赋形剂，其可与本发明的化合物一起施用于患者并且不破坏其药理活性。此外，本文所用的“药学上可接受的载体”或“药用载体”是本领域已知的，包括但不限于0.01-0.1M且优选0.05M磷酸盐缓冲液或0.8％盐水。此外，此类药学上可接受的载体可以是水性或非水性溶液、悬浮液和乳液。非水溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和可注射的有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、酒精/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。胃肠外载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液或不挥发油。静脉内载体包括液体和营养补充剂、电解质补充剂，例如基于林格氏葡萄糖的补充剂等。也可存在防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、比较剂、惰性气体等。
如本文所用，“药物组合物”是指治疗有效量（剂量）的药剂以及药学上可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、赋形剂和/或载体。如本文所用，“治疗有效量”是指为给定病症和方案提供治疗效果的量。此类组合物是液体或冻干或以其他方式干燥的制剂，并包含不同缓冲液含量（例如 Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐）、pH 值和离子强度的稀释剂、添加剂（例如白蛋白或明胶以防止表面吸收）、洗涤剂（例如 Tween 20，吐温 80，Pluronic F68，胆汁盐）。增溶剂（例如甘油、聚乙二醇）、抗氧化剂（例如抗坏血酸、焦亚硫酸钠）、防腐剂（例如硫柳汞、苯甲醇、对羟基苯甲酸酯）、填充剂或张力调节剂（例如乳糖、甘露醇）、聚乙二醇等聚合物的共价键合蛋白质，与金属离子络合或将材料掺入聚合物化合物如聚乳酸、聚乙醇酸、水凝胶等的颗粒制剂中或上，或掺入脂质体、微乳液、胶束、单层或多层囊泡、红细胞影或原生质球上。这样的组合物将影响物理状态、溶解度、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。控释或缓释组合物包括亲脂性贮库制剂（例如，脂肪酸、蜡、油）。本发明还包括涂有聚合物(例如泊洛沙姆或泊洛沙胺)的颗粒组合物。本发明组合物的其他实施方案含有颗粒保护涂层、蛋白酶抑制剂或渗透促进剂，用于各种给药途径，包括胃肠外、肺部、鼻腔和口服给药途径。在一个实施方案中，将药物组合物肠胃外、癌旁、经粘膜、透皮、肌内、静脉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内、颅内、瘤内或更优选地直接给予中枢神经系统（CNS)或外周神经系统（ PNS）病变部位。
此外，术语“药物有效量”或“治疗有效量”是指有效治疗患有例如神经损伤的患者的量（剂量）。在本文中还应理解，“药学有效量”可以解释为产生所需治疗效果的量，可以以任何剂量服用，或以任何剂量服用，或通过任何途径服用，或单独服用或与其他治疗剂联合服用方法。在本发明的情况下，“药物有效量”可以理解为本发明的ADP-核糖基转移酶C3或ADP-核糖基转移酶C3类似物（例如融合蛋白）的量，例如（例如全部或部分） ) 抑制神经元轴突生长，促进轴突生长，防止细胞凋亡，抑制Rho活性，帮助受损轴突再生或帮助神经元与其他细胞建立新的联系。
应当理解，可以对本发明的多肽进行许多修饰，例如活性剂区域（例如，ADP-核糖基转移酶 C3 或 ADP-核糖基转移酶 C3 类似物）或递送剂区域（ HIV Tat 蛋白或 Antennapedia 的同源域）及其片段，而不会对多肽或片段的生物活性产生不利影响。本发明的多肽包括，例如，那些含有已经通过自然过程如翻译后加工或通过本领域已知的化学修饰技术修饰的氨基酸序列的多肽。修饰可以发生在多肽的任何地方，包括多肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。应当理解，相同类型的修饰可以以相同或不同的程度存在于给定多肽的多个位点。此外，给定的多肽可能包含多种类型的修饰。多肽可以由于泛素化而分支，它们可以是环状的，有或没有分支。环状、分支和分支环状多肽可由翻译后自然过程产生或可通过合成方法产生。修饰包括但不限于，例如，乙酰化、酰化、乙酰氨基甲基 (Acm) 基团的添加、ADP-核糖基化、酰胺化、与黄素的共价连接、与血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、共价连接脂质或脂质衍生物的连接、磷脂酰肌醇的共价键、交联、环化、二硫键的形成、去甲基化、共价交联的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒酰化、硫酸化、转移 RNA 介导的氨基酸添加到蛋白质中，例如精氨酰化和泛素化（参考参见蛋白质结构和分子特性，2ndHrsg., T.E.克赖顿，W.H.弗里曼公司，纽约，1993 年）。
其他类型的多肽修饰可以包括例如多肽中的氨基酸插入（即添加）、缺失和取代（即替换），无论是保守的还是非保守的（例如，D-氨基酸、脱氨基酸）序列，这种改变改变多肽的整体生物活性不是必需的。本发明的多肽包括，例如，生物活性突变体、变体、片段、嵌合体和类似物；片段包含具有一个或多个氨基酸的截短的氨基酸序列，其中截短可源自氨基末端（N-末端）、羧基末端（C-末端）或蛋白质内部。本发明的类似物含有一个或多个氨基酸的插入或取代。变体、突变体、片段、嵌合体和类似物可具有本发明多肽的生物学特性，包括例如（但不限于本实施例）促进神经元轴突生长、抑制神经元轴突生长的抑制、促进神经突抑制细胞凋亡、治疗神经损伤、使受伤的轴突再生和/或充当 Rho 拮抗剂。
正如可以举例说明的那样（实施例 13：反向 Tat 序列），在某些情况下，特定多肽中氨基酸的顺序并不重要。关于本文所述的转运剂区域，即使氨基酸不在其原始（如它们在自然界中出现的）顺序（序列）中，也可以保留该区域的转运功能。
替换的例子可以是那些保守的替换（即，用相同一般类型的另一个残基替换一个残基）。当然，天然存在的氨基酸可分为酸性、碱性、中性和极性，或中性和非极性。此外，三个编码的氨基酸是芳香族的。可能有用的是，除了本发明的特定多肽之外的编码多肽包含来自与待替换的氨基酸相同组的氨基酸的取代密码子。因此，在某些情况下，基本氨基酸 Lys、Arg 和 His 可以互换；酸性氨基酸Asp和Glu可以互换；中性极性氨基酸 Ser、Thr、Cys、Gln 和 Asn 可以互换；非极性脂肪族氨基酸 Gly、Ala、Val、Ile 和 Leu 可以互换，但由于大小的关系，Gly 和 Ala 的关系更密切，而 Val、Ile 和 Leu 的关系更密切，而芳香族氨基酸 Phe、Trp , 和 Tyr 可以互换。
还应注意，当合成产生多肽时，也可以用非 DNA 天然编码的氨基酸进行取代。例如，替代残基包括式 NH 的欧米茄氨基酸2个(CH2个)否COOH，其中 n 为 2-6。这些是中性非极性氨基酸，如肌氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸和正亮氨酸。苯基甘氨酸可替代Trp、Tyr或Phe；瓜氨酸和甲硫氨酸亚砜呈中性、非极性，半胱氨酸呈酸性，鸟氨酸呈碱性。羟脯氨酸可以替代脯氨酸并保留赋予构象的特性。
本领域已知突变体或变体可通过置换诱变产生并保留本发明多肽的生物学活性。在这些变体中，蛋白质分子中的至少一个氨基酸残基已被移除，并在其位置插入了一个不同的残基（使用已知的分子生物学技术将 DNA 序列中的一个或多个核苷酸交换为另一个，从而产生不同的氨基酸将相应的信使 RNA 翻译成多肽）。例如，置换诱变感兴趣的位点可包括但不限于鉴定为活性位点或免疫学位点的位点。例如，其他感兴趣的地点可能是从不同物种获得的某些残基相同的地方。这些位置对于生物活动可能很重要。表 1 中显示了被确定为“保守取代”的取代示例。如果此类取代导致不希望的变化，则呈现其他类型的取代，在表1中称为“示例性取代”或如本文关于氨基酸进一步描述的类别，并筛选产物。
在某些情况下，可能感兴趣的是通过氨基酸取代、插入或缺失来修饰多肽的生物学活性。例如，多肽的修饰可导致多肽生物活性的增加，可调节其毒性，可导致生物利用度或稳定性的变化，或可调节其免疫活性或免疫特性。通过选择在维持 (a) 取代区域中的多肽主链结构（例如叶或螺旋构象）方面的效果显着不同的取代，可实现功能或免疫学同一性的实质性改变。 (b) 目标位点分子的电荷或疏水性，或 (c) 侧链的质量。天然存在的残基根据共同的侧链特性分为几组：
- 嗯。疏水物：正亮氨酸、甲硫氨酸 (Met)、丙氨酸 (Ala)、缬氨酸 (Val)、亮氨酸 (Leu)、异亮氨酸 (Ile)
- 二.中性亲水性：半胱氨酸（Cys）、丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）
- 三.酸性：天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）
- 四.基本：天冬酰胺 (Asn)、谷氨酰胺 (Gln)、组氨酸 (His)、赖氨酸 (Lys)、精氨酸 (Arg)
- 五。影响链取向的残基：甘氨酸（Gly）、脯氨酸（Pro）；和
- 因为。芳香剂：色氨酸 (Trp)、酪氨酸 (Tyr)、苯丙氨酸 (Phe)
非保守替代涉及将其中一类的成员换成另一类。
氨基酸序列插入（例如，添加）包括长度范围从一个残基到包含一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。其他插入变体涉及将蛋白质的 N 或 C 末端与同源或异源多肽融合，从而形成嵌合体。嵌合多肽（即嵌合体、多肽类似物）包括与同源或异源序列融合的本发明多肽序列。这些同源或异源序列包括当与本发明的多肽嵌合时保留一种或多种生物学或免疫学特性的序列。
通过同源融合产生的其他类型的嵌合体包括通过重复本发明的两种或多种多肽形成的新多肽。例如，重复次数可以在 2 到 50 个单位之间（即重复）。在某些情况下，具有重复次数大于 50 的新多肽可能是有用的。例如，将诸如 C3APL、C3APLT、C3APS、C3-TL、C3-TS、C3Basic1、C3Basic2 和 C3Basic3 的多肽与其自身（例如与 C3APLT 融合的 C3APLT）或与本发明的另一种多肽连接（例如，C3APLT 融合到 C3APL）。
此外，转运剂，例如HIV Tat蛋白的亚结构域和Antennapedia的同源结构域，可以在包含ADP-核糖基转移酶C3或ADP-核糖基转移酶C3类似物的多肽中重复不止一次。转运剂区域可以在ADP-核糖基转移酶C3或ADP-核糖基转移酶C3类似物的氨基末端区域，或在其羧基末端区域，或在这两个区域。重复转运蛋白区域可能影响（例如，增加）所需细胞对 ADP-核糖基转移酶 C3 或 ADP-核糖基转移酶 C3 类似物的摄取。
异源融合包括通过将本发明的多肽与异源多肽融合而产生的新多肽。此类多肽可包括但不限于细菌多肽（例如，β-内酰胺酶、谷胱甘肽-S-转移酶或由它们编码的酶大肠杆菌trp 基因座）、酵母蛋白、病毒蛋白、噬菌体蛋白、牛血清白蛋白、趋化性多肽、免疫球蛋白恒定区（或其他免疫球蛋白区域）、白蛋白或铁蛋白。
其他类型的多肽修饰包括氨基酸序列的缺失（例如，截短）。这些范围通常为约1至30个残基，更优选约1至10个残基，通常为约1至5个残基。
突变多肽具有一种或多种突变，它们是氨基酸残基的缺失(例如，截短)、插入(例如，添加)或取代。突变体可以是天然存在的（即从天然来源纯化或分离）或合成的（例如，通过对编码 DNA 进行定点诱变或通过化学合成等其他合成方法产生）。因此很明显，本发明的多肽可以是天然存在的或重组的(即通过重组DNA技术产生的)。
通过本领域技术人员已知的方法（例如 Smith, T.F. 和 Waterman M.S. (1981) Ad. Appl. Math., 2:482-489，或Needleman, S.B. 和 Wunsch, C.D. (1970) J. Mol. Biol., 48:443-453)，关于本发明的那些多肽，例如 C3APL、C3APLT、C3APS、C3-TL、C3-TS、C3Basic1、本发明包括C3Basic2和C3Basic3，以及与本发明的蛋白质至少70％或80％且更优选至少90％相同的蛋白质。这通常发生在至少 5 个、优选至少 20 个连续氨基酸的一段上。
如本文所用，术语“变体”是分别不同于参考多核苷酸或多肽但保留基本特性的多核苷酸或多肽。多核苷酸的典型变体在核苷酸序列上不同于另一参考多核苷酸。变体核苷酸序列的改变可能会或可能不会改变由参考多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列。如本文所讨论的，核苷酸改变可导致由参考序列编码的多肽中的氨基酸取代、添加、缺失、融合和截短。多肽的典型变体在氨基酸序列上不同于另一参考多肽。通常，差异是有限的，使得参考多肽和变体的序列总体上非常相似并且在许多区域中是相同的。变体和参考多肽可在氨基酸方面因一处或多处取代、添加、缺失或其任何组合而不同。取代或插入的氨基酸残基可能由或不由遗传密码编码。多核苷酸或多肽变体可以是天然存在的变体，例如等位基因变体，或者它可以是未知天然存在的变体。多核苷酸和多肽的非天然存在的变体可以通过诱变技术或通过直接合成产生。
氨基酸序列变体可通过将适当的核苷酸改变引入DNA或通过体外合成所需多肽来制备。此类变体包括例如氨基酸序列内残基的缺失、插入或取代。如果最终的蛋白质产物具有所需的生物活性或特性，则可以结合删除、插入和替换来获得最终的构建体。氨基酸的变化也可以改变翻译后过程，例如B. 改变糖基化位点的数量或位置，改变膜锚定特性，通过插入、删除或以其他方式影响天然蛋白质的跨膜序列来改变细胞内定位，或改变其对蛋白水解切割的敏感性。
除非另有说明，否则本发明中使用的重组DNA技术是本领域技术人员已知的标准方法。此类技术的示例在参考文献中进行了解释，例如 J Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning，John Wiley and Sons (1984)，J Sambrook 等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press ( 1989)，T.A. Brown（编辑），Essential Molecular Biology：A Practical Approach，第 1 和 2 卷，IRL Press（1991），DM Glover 和 BD Hames（编辑），DNA Cloning：A Practical Approach，第 1-4 卷, IRL Press (1995 and 1996), and F.M. Ausubel et al. （编辑），Current Protocols in Molecular Biology，Greene Pub。 Associates 和 Wiley-Interscience（1988 年，包括迄今为止的所有更新）并通过引用并入本文。
在本文中应当理解，当提及与本发明的特定特征（例如，氨基酸基团、温度、压力、时间等）相关的“范围”或“物质组”时，本发明本文中的发明指代并明确指代其中的任何特定成员及其子部分或子组的任何组合。因此，任何指定的域或组都应被解释为对域或组的每个单独成员以及其中包含的任何可能的子域或子组的速记引用；以及其中任何子部分或子组的类似内容。例如也是
- a) 关于包含多达 50 个碱基单元的序列，应理解为具体包括本文中的每个单独单元以及单元的子范围；
- b) 关于反应时间，1 分钟或更长的时间应理解为在本文中具体包括超过 1 分钟的任何单个时间以及子范围，例如 1 分钟、3 至 15 分钟、1 分钟至20小时、1至3小时、16小时、3小时至20小时等；
- c) 就多肽而言，包含特定序列并在其氨基末端或羧基末端添加至少一个氨基酸的多肽类似物应理解为具体包含任何单一可能性，例如 z 例一、二、三、十、十八、四十等；
- d) 关于多肽，其氨基酸序列与给定氨基酸序列至少 90% 相同的多肽类似物应理解为具体包括任何单一可能性（不包括 100%），例如多肽类似物，其氨基酸序列与给定氨基酸序列有 90%、90.5%、91%、93.7%、97%、99% 等相同；
- e) 关于多肽，其氨基酸序列与给定氨基酸序列至少 70% 相同的多肽类似物被理解为具体包含任何单一可能性（100% 除外），例如多肽类似物，其氨基酸序列与给定的氨基酸序列有 70%、72.3%、73%、88.6%、98% 等相同；
- f) 关于多肽，其氨基酸序列与给定氨基酸序列至少 50% 相同的多肽类似物被理解为具体包含（除了 100%）任何单一的可能性，例如多肽类似物的氨基酸序列与该特定氨基酸序列有 50%、54%、66.7%、70.2%、84%、93% 等相同；
- g)关于多肽，包含至少一个转运蛋白区的多肽理解为具体包括每一种单独的可能性，例如具有一个、两个、五个、十个等转运蛋白区的多肽；和
- h) 也与其他参数有关，例如低压、浓度、元素等。
在本文中还应理解，“g”或“gm”是指重量单位克；和“C”或“°C”。是对温度单位摄氏度的引用。
特别地，本发明提供了可具有添加至C3蛋白的羧基末端的额外氨基酸的C3样蛋白。此类蛋白质的例子包括：
C3APL：（C3-Antennapedia-long）通过将转录因子 Antennapedia 的序列退火到 C3 cDNA 编码序列的 3' 端而生成。使用了包含 Antennapedia 同源域的 60 个氨基酸的长 Antennapedia 序列；
C3APLT：（C3-Antennapedia-shortened）通过将来自 Antennapedia 转录因子的序列退火到编码 C3 cDNA 的序列的 3' 端生成。这种具有移码突变的克隆产生了具有良好转运活性的富含脯氨酸的转运肽。该序列被截断，i。 H。比 C3APL 短。
C3APS：来自 Antennapedia 的具有跨膜转运特性的 11 个氨基酸的短序列被融合到 C3 的羧基末端以产生 C3APS；
C3-TL：C3 Tat-long，由Tat的27-72位氨基酸与C3蛋白的羧基末端融合而成；
C3-TS：通过将氨基酸YGRKRRQRRR(SEQ ID NO：49)与C3蛋白融合生成的C3 Tat-Short；
C3Basic1 一个随机的基本电荷序列加在C3的C端；
C3Basic2：添加到C3的C端的随机基本电荷序列；
C3Basic3：通过将 Tat 氨基酸 RRQRRKKR（SEQ ID NO：50）的反向序列与 C3 蛋白融合而生成的 C3 Tat-Short。
C3-07：C3APLT 的序列经过修饰以去除用于纯化的 GST 序列，并在克隆到 pEt 表达载体后诱导沉默氨基酸变化，但沉默氨基酸变化保留了蛋白质的 ADP-核糖基化活性。
C3-07Q189A：C3-07 的序列，在催化结构域中从 Glu 189 到 Gln 189 的氨基酸取代消除了 ADP-核糖基化活性以产生无活性构建体。
缀合物或融合蛋白（C3 样蛋白） 已发现本发明的 Rho 拮抗剂可有效刺激脊髓损伤后的 CNS 修复。新的 Rho 拮抗剂（新的嵌合 C3）增加的细胞渗透性现在可以治疗中风和神经退行性疾病的患者，因为 Rho 信号通路在中风后修复中很重要（Hitomi 等人 (2000) 67： 1929-39 Trapp 等人 2001 Mol Cell Neurosci 17:883-84)。在粘合剂输送系统中用 Rho 拮抗剂处理可用于增加 PNS 中轴突生长的速率。此外，文献中的证据现在将 Rho 信号通过其激活 PKN 的能力与阿尔茨海默病缠结的形成联系起来，然后磷酸化 tau 和神经丝（Morissette 等人（2000）278：H1769-74.，Kawamata 等人（ 1998) 18:7402-10, Amano 等人 (1996) 271:648-50, Watanabe 等人 (1996) 271:645-8)。因此，预期Rho拮抗剂可用于治疗阿尔茨海默病。新的嵌合 C3 药物应该能够轻松扩散，因此可以促进神经退行性疾病的修复。示例包括但不限于中风、创伤性脑损伤、帕金森病、阿尔茨海默病和肌萎缩侧索硬化。此外，现在已充分确定 Rho 信号转导拮抗剂可有效治疗其他疾病。这些包括但不限于眼部疾病如青光眼（Honjo, et al. (2001) 42:137-44., Rao, et al. (2001) 42:1029-1037），眼部疾病如黄斑变性，视网膜色素变性、Stargardt 病、糖尿病性视网膜病、高血压性视网膜病和闭塞性视网膜病、癌细胞的迁移和转移（Sahai，等人（1999）9：136-45.，Takamura，等人（2001）33：577-81 ., Imamura, et al.(2000) 91:811-6)。 Rho 信号通路对平滑肌松弛的影响是众所周知的。这导致 Rho 信号传导拮抗剂被鉴定为在治疗高血压中有效（Chitaley 等人（2001）3:139-144.，Somlyo（1997）389:908-911，Uehata 等人（1997） ) 389:990-994)、哮喘(Nakahara, et al. (2000) 389:103-6.、Ishizaki, et al. (2000) 57:976-83)、血管疾病(Miyata, et al. ( 2000). ) 20:2351-8., Robertson, et al. (2000) 131:5-9.) 和阴茎勃起功能障碍 (Chitaley, et al. (2001) 7:119-22.)。 Rho 作为心脏保护蛋白也很重要（Lee 等人 2001. FASEB J. 15:1886-1894）。
Rho GTP 酶包括 Rho、Rac 和 Cdc42 蛋白家族的成员。我们的发明涉及 Rho 类的 Rho 家族成员。 Rho 蛋白由不同基因编码的不同变体组成。例如，PC-12 细胞表达 RhoA、RhoB 和 RhoC（Lehmann 等人，1999，同上）； PC-12 细胞：嗜铬细胞瘤细胞系（Greene A. and Tischler, A.S. PNAS 73:2424 (1976)。C3 家族型 Rho 拮抗剂可有效灭活细胞内的 Rho 蛋白，因为它们可阻断所有形式的 Rho（例如 RhoA、Rho B 等）相反，基因治疗技术，例如将显性失活的 RhoA 家族成员引入患病细胞，只会使特定的 RhoA 家族成员失活。
重组 C3 蛋白或保留核糖基化活性的 C3 蛋白在我们的递送系统中也是有效的，并且包括在本发明中。此外，Rho 激酶是活性 Rho 的已知靶标，Rho 激酶的失活与 Rho 的失活具有相同的效果，至少在神经突或轴突长出方面（Kimura 和 Schubert (1992) Journal of Cell Biology. 116:777） -783, Keino-Masu 等人, (1996) Cell.87:175-185, Matsui 等人, (1996) EMBO J. 15:2208-2216, Matsui 等人, (1998) J Cell Biol 140 :647-657, Ishizaki (1997) FEBS Lett 404:118-124)，本发明涉及的生物活性。
本发明的C3多肽包括C3的生物活性片段和类似物；片段包含具有一个或多个氨基酸的截短的氨基酸序列，其中截短可源自氨基末端、羧基末端或蛋白质内部。本发明包括含有 C3 的 Glu(173) 的片段（Saito et al. 1995. FEBS Lett. 371-105）。本发明的类似物含有一个或多个氨基酸的插入或取代。片段和类似物将具有 C3 的生物学特性，能够使 Rho 上 Asn(41) 上的 Rho GTPase 失活。本发明还包括包含与异源氨基酸序列融合的C3氨基酸序列的嵌合多肽。这些异源序列包括那些在与 C3 形成嵌合体时保留 C3 的一种或多种生物学或免疫学特性的序列。用编码C3蛋白或嵌合C3蛋白的核酸转化或转染的宿主细胞也包括在本发明中。可以使用产生具有C3的至少一种生物学特性的多肽的任何宿主细胞。具体实例包括细菌、酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞。此外，可以在转基因动物中产生C3蛋白。使用本领域技术人员常规可用的材料和方法获得转化或转染的宿主细胞和转基因动物。宿主细胞可能含有编码 C3 蛋白全长基因的核酸序列，包括前导序列和 C 端膜锚定序列（见下文），或者可能含有缺少一个或两个前导序列的核酸序列和 C 端膜锚定序列。此外，编码能够保留C3生物活性的多肽的核酸片段、变体和类似物也可存在于宿主表达系统中。
C3 是一种 26 kDa 的蛋白质。全长 C3 蛋白通过 Rho A 的天冬酰胺 41 的 ADP-核糖基化使 Rho 失活（Han 等人 (2001) J. Mol. Biol. 305:95）。保留核糖基化 Rho 能力的截短、延长或改变的 C3 蛋白或 C3 衍生肽包括在本发明中，并可用于制备融合蛋白。已确定 C3 的晶体结构，从而深入了解可在不影响核糖基化活性的情况下改变的 C3 蛋白元素（Han 等人 (2001) J. Mol. Biol. 305:95）。
作为重组蛋白的Rho拮抗剂可以根据本领域已知的方法生产。本发明的蛋白质可以从细菌细胞提取物或通过使用重组技术产生。一般而言，本发明的C3蛋白可以通过在合适的表达载体中用全部或部分C3编码DNA片段转化（转染、转导或感染）宿主细胞来产生。合适的表达载体包括：质粒、病毒颗粒和噬菌体。杆状病毒表达载体适用于昆虫细胞。可以将全部或部分表达载体整合到宿主细胞基因组中。在某些情况下，需要使用诱导型表达载体。
分子生物学领域的技术人员将理解可以使用多种表达系统中的任何一种来提供重组蛋白。所用的精确宿主细胞对本发明并不重要。 C3 和 C3 样蛋白可以在原核宿主（例如大肠杆菌或者枯草芽孢杆菌) 或在真核宿主中（例如酵母菌属或者毕赤酵母属;哺乳动物细胞，例如B. COS、NIH-3T3、CHO、BHK、293 或 HeLa 细胞；或昆虫细胞）。
组织培养生物测定系统可用于确定本发明组合物的相对和有效的Rho拮抗剂活性。浓度范围为约0.01至约10μg/ml(微克/毫克)的融合蛋白例如C3APLT是有用的并且对细胞无毒。
蛋白质和多肽也可以由植物细胞产生。对于植物细胞，病毒表达载体（例如，花椰菜花叶病毒和烟草花叶病毒）和质粒表达载体（例如，Ti 质粒）是合适的。此类细胞可从多种来源获得（例如，美国典型培养物保藏中心，罗克兰，马里兰州）。转化或转染方法以及表达载体的选择取决于所选的宿主系统。
含有表达载体的宿主细胞可以在适合激活选定基因、抑制选定基因、选择转化体或扩增选定基因的常规营养培养基中培养，视情况而定。一种表达系统是用 pMAMneo 表达载体（Clontech，Palo Alto，CA）转染的鼠 3T3 成纤维细胞宿主细胞。 pMAMneo 提供与地塞米松诱导型 MMTV LTR 启动子连接的 RSV LTR 增强子、支持在哺乳动物系统中复制的 SV40 复制起点、可选择的新霉素基因以及 SV40 剪接和聚腺苷酸化位点。编码 C3 或 C3 样蛋白的 DNA 将以允许表达的方向插入 pMAMneo 载体。重组C3或C3样蛋白将如下所述分离。可与 pMAMneo 表达载体结合使用的其他优选宿主细胞包括 COS 细胞和 CHO 细胞（分别为 ATCC 登录号 CRL 1650 和 CCL 61）。
C3多肽可以制成融合蛋白。例如，表达载体可用于产生 Lacz 融合蛋白。 pGEX 载体可用于将外源多肽表达为与谷胱甘肽-S-转移酶 (GST) 的融合蛋白。通常，此类融合蛋白是可溶的，并且可以通过吸附到谷胱甘肽-琼脂糖珠上然后在游离谷胱甘肽存在下洗脱而从裂解细胞中轻松纯化。 pGEX 载体被设计成包含凝血酶或因子 Xa 蛋白酶切割位点，以便克隆的目标基因产物可以从 GST 部分释放。制造融合蛋白的另一种策略是使用 His 标签系统。
在昆虫细胞表达系统中加州亲笔签名核多角体病毒 AcNPV) 生长于草地贪夜蛾细胞，用作表达外来基因的载体。可以将 C3 编码序列单独克隆到病毒的非必需区域（例如多角体基因），并置于 AcNPV 启动子的控制之下，例如B. 多角体启动子。成功插入编码 C3 或 C3 样蛋白（多肽）的基因会导致多角体基因失活并产生非包囊重组病毒（即，缺少由多角体基因编码的蛋白质包膜的病毒） .然后将这些重组病毒用于感染草地贪夜蛾表达插入基因的细胞（参见 Lehmann 等人的生产重组 MAG 蛋白的示例）。
多种病毒表达系统可用于哺乳动物宿主细胞。在使用腺病毒作为表达载体的情况下，C3核酸序列可以连接到腺病毒转录/翻译控制复合物，例如晚期启动子和三联前导序列。然后可以通过体外或体内重组将该嵌合基因插入腺病毒基因组中。插入病毒基因组的非必需区域（例如，E1 或 E3 区域）会导致重组病毒存活并能够在受感染的宿主中表达 C3 基因产物。
插入的核酸序列的有效翻译也可能需要特定的起始信号。这些信号包括 ATG 起始密码子和相邻序列。在将完整的天然 C3 基因或 cDNA（包括其自身的起始密码子和相邻序列）插入到适当的表达载体中的情况下，可能不需要额外的翻译控制信号。在其他情况下，必须提供外源性翻译控制信号，可能包括 ATG 起始密码子。此外，起始密码子必须与所需编码序列的阅读框同相，以确保整个插入片段的翻译。这些外源性翻译控制信号和起始密码子可以有各种来源，包括天然的和合成的。可以通过包含适当的转录增强子元件、转录终止子来提高表达效率。
此外，可以选择调节插入序列的表达或以特定的所需方式修饰和加工基因产物的宿主细胞。蛋白质产物的此类修饰（例如，糖基化）和加工（例如，切割）可能对蛋白质的功能很重要。不同的宿主细胞对蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰具有特征和特定机制。可以选择合适的细胞系或宿主系统来确保表达的外源蛋白的正确修饰和加工。为此，可以使用具有适当加工初级转录物、基因产物的糖基化和磷酸化的细胞机制的真核宿主细胞。此类哺乳动物宿主细胞包括但不限于 CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、W138，尤其是脉络丛细胞系。
或者，C3 蛋白可由稳定转染的哺乳动物细胞系产生。许多适用于稳定转染哺乳动物细胞的载体可供公众使用；构建此类细胞系的方法也是公开的。在一个例子中，可以将编码 C3 蛋白的 cDNA 克隆到含有二氢叶酸还原酶 (DHFR) 基因的表达载体中。通过在细胞培养基中加入 0.01-300 μM（微摩尔）甲氨蝶呤来选择质粒以及 C3 或 C3 样蛋白编码基因整合到宿主细胞染色体中（如上文 Ausubel 等人所述）。这种显性选择可以在大多数细胞类型中实现。重组蛋白表达可以通过 DHFR 介导的转染基因扩增来增加。选择携带基因扩增的细胞系的方法是本领域已知的；这些方法通常涉及在含有逐渐增加的甲氨蝶呤水平的培养基中进行长时间培养。通常用于此目的的含有 DHFR 的表达载体包括 pCVSEII-DHFR 和 pAdD26SV(A)。任何上述宿主细胞，或优选 DHFR 缺陷型 CHO 细胞系（例如，CHO-DHFR 细胞，ATCC 保藏号 CRL 9096），都属于优选用于稳定转染细胞系或 DHFR 的 DHFR 选择的宿主细胞。介导的基因扩增。
可以使用许多其他选择系统，包括但不限于分别用于 tk、hgprt 和 aprt 细胞的单纯疱疹病毒胸苷激酶、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶和腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因。还有 gpt，赋予霉酚酸抗性； neo，赋予对氨基糖苷类 G-418 的抗性；可以使用赋予潮霉素抗性的Hygro。
或者，可以使用对表达的融合蛋白特异的抗体容易地纯化每种融合蛋白。例如，Janknecht 等人描述的系统。 (1981) 过程。国家的学术科学。 USA 88 , 8972 可以轻松纯化在人细胞系中表达的未变性融合蛋白。在这个系统中，感兴趣的基因被亚克隆到牛痘重组质粒中，这样基因的开放阅读框被翻译融合到由六个组氨酸残基组成的氨基末端标记。感染重组痘苗病毒的细胞提取物被加载到 Ni2+ 次氮基乙酸琼脂糖柱上，组氨酸标记的蛋白质用含咪唑的缓冲液选择性洗脱。
或者，C3、C3 样蛋白或其部分（片段）可以与免疫球蛋白 Fc 结构域融合。这种融合蛋白可以很容易地使用蛋白 A 柱进行纯化。
组织培养生物测定系统用于测定 Rho 拮抗剂的活性。该生物测定用于确定在脊髓损伤、中风或神经退行性疾病中有效促进轴突再生的 Rho 拮抗剂的活性。
神经元不会在抑制性髓鞘底物上形成神经突。当组织培养中的神经元被放置在抑制性底物上时，它们保持圆形。当加入强效 Rho 拮抗剂时，神经元可以在髓鞘基质上长出神经突。添加 Rho 拮抗剂后神经元长出神经突所需的时间与神经元接种在层粘连蛋白或聚赖氨酸等促生长底物上的时间相同，在细胞培养中通常为 1 至 2 天。可以目视评估结果。如果需要，可以对神经突生长进行定量评估。这包括测量 a) 对照培养物中的神经突长度，其中神经元被接种在髓磷脂基质上并且未经处理，b) 在阳性对照培养物中，例如接种在多聚赖氨酸上的神经元，c) 或用不同浓度的测试拮抗剂处理培养物。
为了测试组织培养中的 C3，发现最佳浓度为 25-50 µg/ml。 (Lehmann 等人，1999. J. Neurosci. 19:7537-7547；Jin & Strittmatter, 1997. J. Neurosci. 17:6256-6263)。因此，与用于刺激神经突长出的生长因子相比，需要高浓度的这种 Rho 拮抗剂。神经生长因子 (NGF) 等生长因子在组织培养中的使用浓度为 1-100 ng/mL。然而，生长因子无法克服髓磷脂的生长抑制。我们的组织培养实验都是在视网膜神经节细胞生长因子 BDNF 或 PC-12 细胞生长因子存在的情况下进行的。当在体内测试生长因子时，通常使用 µg/mL 范围内的最高可能浓度。它们也经常使用泵递送至 CNS 以延长递送时间（例如，Ramer 等人，同上）。对于体内实验，在使用以 1 mg/mL 冷冻溶液形式储存的 C3 时，使用了尽可能高的浓度。
Rho 拮抗剂 C3 在 37°C 下稳定至少 24 小时。通过以下实验在组织培养中测试 C3 的稳定性。 C3 在组织培养基中稀释，在 37°C 下孵育 24 小时，然后添加到上述使用视网膜神经节细胞作为测试细胞类型的生物测定系统中。当用在 37°C 下储存的 C3 处理 24 小时时，这些细胞能够在抑制性底物上扩展神经突。因此，最低稳定性为 24 小时。这与基于氨基酸组成的稳定性预测一致（参见下面的序列数据）。
可以通过以下方式之一确认化合物是 Rho 拮抗剂：
- A. 细胞如上所述在生长抑制底物上培养并暴露于候选 Rho 拮抗剂；
- B. 将来自步骤 a) 的细胞均质化并进行下拉测定。该测定基于 GST-rhotectin 与 GTP 结合的 Rho 结合的能力。将重组 GST-rhotectin 或 GST-rhotectin 结合结构域 (GST-RBD) 添加到由如 a) 中培养的细胞制备的细胞匀浆中。发现抑制性底物激活 Rho，并且该激活的 Rho 被 GST-RBD 拉低。 Rho 拮抗剂阻断 Rho 的激活，因此当细胞按上述 a) 所述培养时，有效的 Rho 拮抗剂阻断 Rho 的检测；或者
- C. 这种 pulldown 测定的另一种方法是使用 GTPase 激活蛋白 Rho-GAP 作为测定中的诱饵来拉低激活的 Rho，如所述（Diekmann 和 Hall，1995。在酶学方法，第 256 卷，部分B 207-215）。
另一种确认化合物是 Rho 拮抗剂的方法如下：当添加到活细胞中时，通过检测 Rho 的分子量变化可以识别通过效应域的 ADP-核糖基化使 Rho 失活的拮抗剂（Lehmann 等人， 1999，同上）。在用 Rho 拮抗剂处理细胞后，可以通过使细胞均质化并通过 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离细胞匀浆中的蛋白质来检测分子量变化。将蛋白质转移到硝酸纤维素纸上，然后通过蛋白质印迹技术用 Rho 特异性抗体检测 Rho。
另一种确认该化合物是Rho激酶拮抗剂的方法如下：
- A. 带有 myc 表位标签或 GST 标签或任何合适标签的重组 Rho 激酶通过转染在 Hela 细胞或其他合适的细胞类型中表达；
- B. 使用针对特定标签（例如 myc 标签或 GST 标签）的抗体通过免疫沉淀从细胞匀浆中纯化激酶；和
- C. 从 b) 中获得的免疫沉淀物用 [32P] ATP 和组蛋白 2 型作为底物，存在或不存在 Rho 激酶抑制剂。在没有 Rho 激酶抑制活性的情况下，Rho 激酶使组蛋白磷酸化。在 Rho 激酶抑制剂的存在下，Rho 激酶的磷酸化活性（即组蛋白的磷酸化）被阻断，将该化合物鉴定为 Rho 激酶拮抗剂。
现在转向本发明缀合物的递送侧，已知方法可用于添加允许蛋白质进入细胞的递送序列；示例包括膜易位序列（Rojas (1998) 16:370-375）、Tat 介导的蛋白质递送（Vives (1997) 272:16010-16017）、聚精氨酸序列（Wender 等人，2000 年，PNAS 24:13003-13008）和天线百科全书（Derossi (1996) 271:18188-18193）。已知的转运剂、分组、子域等的例子也描述于例如加拿大专利文件No. 2,301,157 (Conjugates Containing Antennapedia's Homeodomain)和美国专利No.美国专利号5,652,122、5,670,617、5,674,980、5,747,641和5,804,604(含有Tat HIV蛋白氨基酸的缀合物(下文中Tat HIV蛋白有时简称为Tat))；这些专利文件的全部内容通过引用并入本文记录。
Antennapedia 同源结构域的第三个 α 螺旋的 16 个氨基酸区域已显示允许蛋白质（作为融合蛋白产生）穿过细胞膜（PCT 国际公开号 WO 99/11809 和加拿大申请号：2,301,157（Crisanti 等人） , ) 并入本文作为参考）。在这里，我们已经生成了包含 C3 的融合蛋白，并且具有位于融合蛋白的羧基末端的 Antennapedia 同源域序列。这些融合蛋白的生物活性（例如促进轴突生长）已在原代哺乳动物细胞（如神经元）上得到证实。同样，HIV Tat 蛋白已被证明能够穿过细胞膜（Frankel A.D. 等人，Cell，55：1189）。我们在此表明，使用跨越 HIV Tat 的氨基酸 27 到 72 的序列，Tat 介导的生物活性 C3 蛋白的递送在神经元细胞中是可能的，特别是在原代神经元细胞中。
除了 HIV Tat 和 Antennapedia 介导的 C3 蛋白和类似物转运外，此处还介绍了新的转运序列（即转运多肽部分、转运剂区域等）。
几种受体介导的递送策略已被用于尝试和改善 ADP-核糖基酶的功能：这些方法包括融合 C2 和 C3 序列（Wilde，等人（2001）276：9537-9542）和使用受体介导的运输涉及白喉毒素受体（Aullo, et al. (1993) 12:921-31；Boquet, P. et al. (1995) Meth. Enzymol. 256:297-306）。尚未证明这些方法能显着提高 C3 的效力。此外，这些蛋白质需要受体介导的转运。这意味着细胞必须表达受体并表达足够量的受体以显着增强运输。此外，当 C3 通过内吞作用进入细胞时，它会被困在膜室中，因此大部分无法使 Rho 失活。就白喉毒素而言，并非所有细胞都表达适当的受体，这限制了它的潜在用途。这些的临床意义尚未经过测试或证明。还制作了 C2/C3 融合蛋白以尝试提高 C3 的效力。在这种情况下，需要将 C211 结合蛋白与 C2-C3 融合毒素一起添加到组织培养基中，以允许通过受体介导的内吞作用摄取 C3（Barthe 等人（1998）Infection and Immunity 66:1364 ).该系统的缺点是细胞中的大部分 C3 保留在膜室中。更重要的是，必须分别添加两种不同的蛋白质才能进行运输（Wahl 等人 2000. J. Cell Biol. 149:263），这使得该系统难以应用于体内治疗疾病。此外，没有一种用 C3 或 C3 类似物（C3 样蛋白）使 Rho 失活的方法已被证明足以克服组织培养中的生长抑制或促进体内 CNS 损伤后的恢复。
根据本发明可以使用的一种策略是利用天线足同源结构域，它能够通过受体非依赖性机制将蛋白质转运穿过质膜（Derossi（1996）271：18188-18193）；另一种策略是利用 tat 介导的递送（Vives (1997) 272:16010-16017，Fawell (1994) 91:664-668，Frankel (1988) 55:1189-1193）。
Antennapedia 策略已用于神经元中的蛋白质易位 (Derossi (1996) 271:18188-18193)。例如，Antennapedia 用于递送生物素标记的肽以证明该技术的有效性；见美国专利。第 6,080,724 号（该专利的全部内容通过引用并入本文）。 Antennapedia 在体外增强神经元的生长和分支（Bloch-Gallego (1993) 120:485-492）。同源蛋白是调节身体组织发育的转录因子，Antennapedia 就是其中之一果蝇同源蛋白。另一方面，Tat 是人类免疫缺陷病毒 (HIV) 的调节蛋白。它是一种存在于细胞核中的高碱性蛋白，能够将报告基因转运到细胞中。此外，Tat-偶联蛋白可以在腹膜内注射后进入细胞，甚至可以穿过血脑屏障进入脑内细胞(Schwarze, et al. (1999) 285:1569-72)。
在其他情况下测试过的其他传输序列（即显示它们使用报告序列工作）是已知的。一种转运肽，一种 12 聚体 AAVLLPVLLAAP（SEQ ID NO：51）富含脯氨酸。它作为 GST-MTS 融合蛋白产生，并衍生自 Kaposi FGF 信号序列的 h 区（Royas 等人，1998 Nature Biotech. 16：370-375）。 ID NO:52)（Pecheur, J. Sainte-Marie, A. Bienvenuie, D. Hoekstra. 1999. J. Membrane Biol. 167:1-17 对此进行了综述）。然而，必须注意的是，α-螺旋脯氨酸 (Pro) 残基断裂的倾向并不是一般规则，因为假定的精子-Fertilin-α 融合肽在脂质体存在下具有高的 α-螺旋含量。然而，Fertiliner 的高效融合特性所需的 Pro-Pro 序列是我们测试的 C3APLT 融合蛋白满足具有两个脯氨酸以产生有效转运肽的要求。因此，富含脯氨酸的序列和具有螺旋结构的随机序列-需要断裂倾向，作为有效的转运蛋白，如果与 C3 融合也会有效。
在轴突在抑制性底物上生长、损伤后轴突再生或大脑或脊髓中轴突再生的背景下，尚未开发出使用这些运输序列的方法。特别值得注意的是，Antennapedia 促进生长的能力是使用放置在层粘连蛋白涂层盖玻片上的神经元进行测试的。层粘连蛋白支持轴突生长并克服生长抑制（David，等人（1995）42：594-602），因此它不是测试再生潜力的合适底物。在过去的 20 年里，有大量关于在如此有利的组织培养条件下促进轴突生长的化合物的文献，但没有一个在治疗脊髓损伤方面取得临床进展。 Antennapedia 的作用已被证明与生长因子的作用相似。生长因子不能克服 CNS 生长抑制底物的生长抑制作用（Lehmann 等人（1999）19：7537-7547，Cai 等人（1999）22：89-101）。体内应用的生长因子不支持再生，仅支持发芽（Schnell 等人（1994）367：170-173）。
可以将转运序列添加到 C3 蛋白的 N 端（氨基端）序列。或者，可以将转运序列添加到 C3 蛋白的 C 末端（羧基末端）；由于 C 终端已经相当基本，这应该会进一步改善传输特性。这可能是 C3APLT 除了其碱基电荷和富含脯氨酸的序列外还显示活性的原因之一。
新的嵌合C3可用于治疗脊髓损伤，促进功能修复。我们已经表明，C3APLT 和 C3APS 都可以克服对包括髓磷脂和混合硫酸软骨素蛋白聚糖在内的复杂抑制底物的生长抑制。此外，我们表明，C3APLT 在应用于成年小鼠受伤的脊髓后可以促进功能恢复。新的嵌合蛋白可用于促进轴突再生并减少中枢神经系统损伤后的瘢痕形成。疤痕是神经再生的障碍。
新的嵌合 C3 的优点是能够在受伤和治疗之间的显着延迟后治疗受伤的轴突。新的重组蛋白也可用于治疗慢性损伤。嵌合 C3 还可用于治疗神经退行性疾病，如阿尔茨海默病和帕金森病，其中需要 Rho 拮抗剂渗透到受影响的神经元群中才能进行有效治疗。嵌合 C3（融合蛋白）也可用于治疗中风和创伤性脑损伤。此外，大量证据表明治疗癌细胞迁移的功效。 Rho拮抗剂还可用于治疗涉及平滑肌的病症，例如血管疾病、高血压、哮喘和阴茎功能障碍。
对于脊髓损伤的治疗，本发明的结合的Rho拮抗剂可以与细胞移植结合使用。许多不同的细胞移植已被广泛测试其促进再生和修复的潜力，包括但不限于雪旺细胞、经过修饰以表达生长因子的成纤维细胞、胎儿脊髓移植、巨噬细胞、胚胎或成体干细胞以及嗅鞘胶质细胞。 C3 融合蛋白可与神经营养蛋白、细胞凋亡抑制剂或其他防止细胞死亡的药物结合使用。它们可以与细胞粘附分子结合使用，例如 L1、层粘连蛋白和促进轴突生长的人工生长模板。本发明的嵌合C3构建体也可以与阻断生长抑制蛋白底物以促进轴突长出的抗体结合使用。此类抗体方法的实例是使用 IN-1 或相关抗体（Schnell 和 Schwab (1990) 343:269-272）或通过使用治疗性疫苗方法（Huang (1999) 24:639-647）。
本发明的组合物可以例如通过静脉内递送至眼睛、通过植入包含本发明组合物的储库、通过注射入眼或注射入眼近端组织而施用于眼。
眼球嵌入眼眶脂肪中，由一层薄膜（即球筋膜）与眼眶脂肪隔开，从视神经到睫状区域将球囊包裹起来。筋膜的光滑内表面通过巩膜周淋巴间隙与巩膜外表面分开，后者过渡到硬膜下腔和蛛网膜下腔。筋膜被睫状血管和神经穿孔，并与视神经鞘和视神经入口周围的巩膜融合。视神经从他的鼻子侧面进入他的眼球约 3 毫米，略低于他的后曲率中点的水平。视神经纤维的生长是向心性的，在其形成过程中，大部分视神经纤维从视网膜的神经细胞向后生长进入视神经柄，但也有部分视神经纤维延伸并来源于大脑的神经细胞。视神经的纤维层主要由视网膜神经节细胞轴突组成，它通过视神经投射并支持神经胶质细胞到达大脑。
眼睛的外层由巩膜和角膜组成。巩膜是一种不透明的实心膜，厚度可达 1 毫米，构成眼睛后部的六分之五。巩膜由混合有细弹性纤维的白色纤维组织组成；在纤维的细胞间隙中有扁平的结缔组织体，其中一些有色素。本发明的组合物可以例如通过注射入和/或通过巩膜，或通过在接近巩膜和/或在巩膜中，优选在眼睛后部形成储库来施用。
巩膜内表面与脉络膜外表面之间被巨大的淋巴间隙或脉络膜周膜隔开，细小的细胞组织即脉络膜上层穿过。巩膜被视神经刺穿并通过该神经的纤维鞘与硬脑膜连续。在视神经穿过巩膜的地方，巩膜形成薄的筛板，即筛板巩膜。该层中的微小开口用于神经纤维的传输，并且远离筛板的视网膜神经节细胞的轴突由少突胶质细胞形成髓鞘。分隔它们的纤维隔膜合并到分隔神经纤维束的膜突中。其中一个开口比其他开口大，占据了叶片的中间；它传输视网膜的中央动脉和静脉。视神经入口周围有许多小孔供睫状血管和神经传输。大约在这个入口和巩膜角膜交界处的中点处有四五个大开口，用于传输静脉，即 venæ vorticosæ。本发明的组合物可以例如通过注射或灌注，或从储库（例如包含本发明组合物的植入基质）施用到向视网膜供血的血管中，优选靠近视网膜的区域。黄斑。
眼睛的血管皮肤由脉络膜、睫状体和虹膜组成。脉络膜包括靠近视网膜的眼球的后六分之五，并向前延伸至视网膜的锯齿状缘。睫状体将脉络膜连接到虹膜周边。
脉络膜由巩膜和视网膜之间的薄海绵层组成；脉络膜充满血管。脉络膜是一层薄的、富含血管的深棕色膜，包围着眼球的后六分之五；它被视神经向后刺穿，在这种情况下牢固地粘附在巩膜上。后面比前面厚。它的外表面通过脉络膜上层松散地连接到巩膜；它的内表面附着在视网膜的色素层上。本发明的组合物可以例如通过注射或灌注，或从储库（例如包含本发明组合物的植入基质）施用到向脉络膜供血的血管中，优选靠近脉络膜的区域。黄斑。
脉络膜主要由致密的毛细血管丛和输送血液进出该丛的小动脉和静脉组成。它的外表面是一层薄膜，称为脉络膜上层，由脆弱的无血管薄层组成。每个薄片由细弹性纤维网络组成，在这些网络之间是分支的色素细胞。薄片之间的空间由内皮衬里并自由地通向脉络膜周淋巴空间，后者通过血管和神经传输的巩膜穿孔与巩膜周围空间相通。在这些薄层内是脉络膜本身，它由两层组成：外层由散布着色素细胞的小动脉和静脉组成；和由毛细血管丛组成的内层。外层或血管层由部分睫状短动脉的较大分支组成，睫状动脉在向内弯曲并终止于毛细血管之前在静脉之间向前通过。涡旋静脉主要由合并成四个或五个等距主干的静脉形成，这些主干在巩膜角膜交界处和视神经入口之间的中途刺穿巩膜。散布在血管之间的是深色星状色素细胞，其突起与邻近细胞的突起一起形成精致的网络或基质，其朝向脉络膜内表面失去其色素特征。脉络膜或脉络膜毛细血管层的内层由由短睫状血管形成的非常细的毛细血管网络组成。该网络在脉络膜后部比在前部更密集、更精细。在角膜后方约 1.25 厘米处，它们的网眼变大并与睫状突的网眼融合。这两层板由由细弹性纤维组成的中间层连接。在脉络膜毛细血管板的内侧是一层非常薄的、无结构或弱纤维的膜，即基底层，它与脉络膜的基质紧密相连，并将其与视网膜的色素层隔开。
视网膜是眼睛中的神经组织，包含数百万个视杆细胞和视锥细胞，这些细胞将光能转化为化学电信号或神经信号，这些信号通过视神经发送到大脑。视网膜的外表面与脉络膜接触。视网膜的内表面与玻璃体液的透明膜接触。继续看视神经，视网膜的厚度从眼睛后部向前逐渐减小，几乎延伸到睫状体，在那里它似乎终止于锯齿状边缘，锯齿缘。在锯齿缘处，视网膜的神经组织终止，但膜的薄延伸部分向前延伸到睫状突和虹膜的背面，形成视网膜睫状体和虹膜部。由于视紫红质的存在，视网膜是柔软的、半透明的和紫色的。
黄斑位于视网膜后部的中间，对应于视力最敏锐的眼轴，即。 H。其中更精细或更高分辨率的视觉细节和视觉焦点是最大程度的视敏度。黄斑由颜色最深的椭圆形淡黄色区域组成，朝向中心，大约 6 x 7 毫米 (mm)。中央凹包括黄斑中的中央凹陷，其中视网膜非常薄。中央凹的直径约为 1.5 毫米，位于黄斑后方，是视锥细胞最集中的地方。在眼睛内部，光线通过晶状体聚焦到中央凹上，以实现直视和精细细节。
黄斑的神经节层（视网膜的神经节层（RGC层））由数层细胞组成。没有视杆细胞，只有视锥细胞，它们比视网膜的其他部分更长更窄。外核层只有锥细胞，突起很长，呈曲线排列。中央凹的层由锥细胞加上外核层组成，外核层的锥纤维几乎水平取向，加上薄的内丛状层。
黄斑部鼻侧约3毫米处为视神经入口，即视神经乳头，视神经乳头周长稍增大，形成隆起或视神经丘；视网膜中央动脉穿过椎间盘的中心。视网膜表面的这一部分称为盲点，对光不敏感。视神经和视网膜中央血管在盲点的视盘处进入眼睛后部。
视网膜中央动脉及其伴行静脉穿过视神经并通过视孔进入眼球。动脉立即分叉为上支和下支，每支又分为内侧支或鼻支和外侧支或颞支，首先穿过玻璃体膜和神经层之间，然后进入后者以推进到达。二分法。一个微小的毛细血管丛从这些分支中分支出来，并且不会突出到内核层之外。黄斑接受两个小分支，即来自颞支的黄斑上动脉和黄斑下动脉，以及直接来自中央动脉的小动脉分支。这些不会进入无血管中央凹。视网膜中央动脉的分支彼此不吻合，即它们是终末动脉。
视网膜的神经结构由许多非神经性或支持性纤维支撑，视网膜由七层组成：视神经层或纤维层，由视网膜神经节细胞 (RGC) 轴突组成；神经节层或 RGC 层，由 RGC 的细胞体和一些移位的无长突细胞组成；内丛状层由RGCs的树突和无长突细胞组成；内核层或含有视网膜中间神经元细胞体的层；外丛状层，含有树突的层；外核层，由感光细胞的细胞体组成；以及视杆和视锥层。
视神经层由延伸至视神经的 RGC 轴突形成。当神经纤维穿过筛板向眼睛移动时，它们会失去有髓鞘，并作为简单的无髓轴突继续穿过脉络膜和视网膜。当它们到达视网膜的内表面时，它们从它们的进入点以簇的形式辐射到整个表面，并在许多地方排列成神经丛。大多数纤维是向心的，是 RGC 层细胞的轴-圆柱过程的直接延续，但其中一些是离心的，并在内部丛状层和内核层中分支出来，在那里它们终止于扩大的四肢。
RGC 层由单层大神经节细胞组成，黄斑除外，那里有多层神经节细胞。神经节细胞休息，每个神经节细胞发出一个细长的轴突进入视层。许多树突延伸到内部丛状层，在那里它们分枝并形成不同层次的平顶分枝。神经节细胞大小不等，较小者的树突一进入内丛状层就分枝；而较大细胞的树突在内核层附近分支。
内丛状层由致密的细小原纤维网状结构组成，这些原纤维由神经节细胞的树突与内核层细胞的树突交织而成；一些分枝的成海绵细胞有时嵌在这个网状结构中。
内核层或内部颗粒层（细胞）包括三种类型的密集细胞：双极细胞、水平细胞和无长突细胞。双极细胞数量最多，呈圆形或椭圆形。每个都被延长为一个内部和一个外部过程。它们可分为杆状双极和锥状双极。杆状双极的内部突起穿过内丛状层并围绕神经节层的细胞体分支；它们的外部突起终止于围绕杆状细胞内部突起末端的原纤维簇中的外丛状层。锥形双极的内部突起在内丛状层中分支，与神经节细胞的树突接触。水平细胞具有扁平的细胞体，位于内核层的外部。它们的树突在外丛状层分成许多分支，而它们的轴突水平延伸一段距离并最终在同一层分支。无长突细胞位于内核层的内部。它们的树突在内丛状层中进行广泛的分支。
外丛状层比内丛状层薄，由来自前一层水平细胞突起的细小原纤维的致密网络组成。杆状和锥状双极细胞的分支外突在杆状纤维的扩大端周围形成分支，并与锥状纤维的分支足板形成分支。
外核层与内核层一样，包含两种类型的细胞体：杆状细胞和锥状细胞，每个都与下一层的杆状细胞和锥状细胞相连。杆状体比锥体多得多，并且位于层中的不同级别。从每个杆细胞的每一端延伸出一个精细的过程，其中一个与杆锥层的单个杆连续，而另一个终止于外丛状层的扩大端并嵌入簇中杆状双极细胞的外部裂口打开。锥体位于外膜限制器附近，通过它们连接到杆锥层的锥体。从锥体的一端，一个粗突进入外丛状层，在那里它扩展成锥体延伸或足板，从中释放出许多细小的原纤维，与锥体双极细胞的外突接触.
视杆-视锥层由视杆和视锥（感光细胞）组成，除黄斑外，前者比后者多得多。这些杆是圆柱形的，厚度几乎均匀，并垂直于表面排列。每根杆由两段组成，一外一内，长度大致相等。外段的特点是横向条纹，往往会分解成许多彼此重叠的薄片。内段较深部分呈颗粒状；它的更表层部分显示出纵向条纹，由强烈断裂的细纤维组成。视紫红质仅存在于外部部分。锥体呈圆锥形，宽端靠在外膜上，窄端面向脉络膜。像杆一样，每个杆都由两部分组成，一个是外部，一个是内部；外节为短锥形突起，与杖的外节一样，有横纹。内节在结构上与棒状的内节相似，具有表面条纹和深颗粒状部分，但不同之处在于横向隆起和活塞状。这两部分的化学和光学特性与棒的相同。
如本文所用，术语视网膜细胞可指包含视网膜的任何细胞类型，例如视网膜神经节细胞、无长突细胞、水平细胞、双极细胞和感光细胞，包括视杆细胞和视锥细胞、Muller神经胶质细胞和视网膜色素上皮。
晚期湿性黄斑变性是一种眼病，涉及位于黄斑感光细胞下方的脉络膜组织的新血管形成。黄斑变性，特别是在其晚期阶段，其特征在于黄斑下方的脉络膜中新血管的病理性生长。视网膜下脉络膜中的血管生成血管可能会渗漏，影响视力并导致失明。
一方面，表现出视网膜近端新生血管形成的眼睛疾病，例如湿性黄斑变性、色素性视网膜炎、斯塔加特氏病、糖尿病性视网膜病、高血压性视网膜病和闭塞性视网膜病，可以通过给予本发明的组合物包含具有血管生成抑制活性的本发明的融合蛋白。
在另一方面，可以治疗表现出靠近视网膜的新生血管形成的眼睛疾病，例如湿性黄斑变性、色素性视网膜炎、斯塔加特氏病、糖尿病性视网膜病、高血压性视网膜病和闭塞性视网膜病，以预防或减少感光细胞死亡。本发明的组合物包含本发明的融合蛋白。
当将本发明的组合物施用于眼或引流到患者眼中的血管时，可用于治疗诸如湿性黄斑变性、视网膜色素变性、斯塔加特氏病、糖尿病性视网膜病、高血压性视网膜病和闭塞性视网膜病等疾病，它们减少新血管形成的速度，从而减缓疾病的进展。患者在这种疾病中发生的新血管形成率优选通过施用本发明的融合蛋白，更优选至多5％，甚至更优选至多1％，并且最优选至多0.1％(倍)在这种疾病中在没有施用融合蛋白的情况下发生的新血管形成率本发明的（即，在未治疗的患者中）。
当将本发明的组合物施用于眼或引流到患者眼中的血管时，可用于治疗诸如湿性黄斑变性、视网膜色素变性、斯塔加特氏病、糖尿病性视网膜病、高血压性视网膜病和闭塞性视网膜病等疾病，它减少感光细胞的死亡率，从而减缓疾病的进展。通过施用本发明的融合蛋白，在患者中出现这种疾病的感光细胞死亡率优选降低至不超过 90%，更优选不超过 50%，甚至更优选不超过 25% .甚至更优选不超过 10%，甚至更优选不超过 5%，甚至更优选不超过 1%，最优选不超过 0.1%（倍）在没有施用本发明的融合蛋白的情况下的疾病（即未治疗的患者）。
疾病导致的视网膜近端新血管形成，特别是黄斑近端新血管形成，可导致患者视网膜中的感光细胞死亡。由于新血管形成以及其他细胞死亡机制导致的视网膜疾病，可以诱导视网膜中的感光细胞死亡。
晚期干性黄斑变性涉及玻璃膜疣的沉积和感光细胞的死亡。玻璃膜疣沉积的机制尚不清楚，但细胞的胞吐作用可能是释放到细胞外空间的机制。本发明的另一个实施方案涉及通过细胞可渗透的融合蛋白缀合物抑制玻璃膜疣沉积和防止感光细胞死亡，所述融合蛋白缀合物包含多肽，所述多肽包含与药物的氨基酸序列共价连接的转运剂的氨基酸序列。其中药物的氨基酸序列由ADP-核糖基转移酶C3或其保留ADP-核糖基转移酶活性的片段组成，其中递送剂的氨基酸序列促进细胞摄取药物，例如融合蛋白如C3APLT。在一方面，a的功能类似物肉毒杆菌C3 外转移酶部分包含一种蛋白质，其 ADP-核糖基转移酶活性在 ADP-核糖基转移酶活性的 50% 至 500% 范围内肉毒杆菌C3 外转移酶。在穿透细胞膜后通过本发明的融合蛋白使细胞中的Rho失活可以阻断或抑制胞吐作用，从而阻断或抑制细胞碎片或能够形成玻璃膜疣的细胞衍生物质从细胞中释放。本发明的融合蛋白还可以防止中枢神经系统中细胞的损伤诱导的细胞死亡。
新血管形成中的血管生成是血管形成的复杂过程。该过程涉及生化和细胞事件，包括 (1) 血管生成刺激激活内皮细胞 (EC)； (2) 细胞外基质的降解，活化的内皮细胞渗透到周围组织并迁移到血管生成刺激源； (3)内皮细胞的增殖和分化形成新血管(Folkman et al., 1991, J. Biol. Chem. 267:10931-10934)。
血管生成的控制是一个高度调节的过程，涉及血管生成刺激剂和抑制剂。在健康的人类和动物中，血管生成发生在某些受限条件下。例如，通常在胎儿和胚胎发育、正常组织和器官的发育和生长、伤口愈合以及黄体、子宫内膜和胎盘的形成中观察到血管生成。本发明的另一个实施方案涉及通过可渗透细胞的融合蛋白缀合物抑制血管生成，所述融合蛋白缀合物包含多肽，所述多肽包含与药物的氨基酸序列共价连接的转运剂的氨基酸序列，其中药物的氨基酸序列转运剂是由ADP-C3核糖基转移酶或其保留ADP-核糖基转移酶活性的片段组成的试剂，其中转运剂的氨基酸序列促进细胞摄取药物，例如融合蛋白如C3APLT。在一方面，a的功能类似物肉毒杆菌C3外转移酶部分包含ADP-核糖基转移酶活性在ADP-核糖基转移酶活性的50%至500%或更高范围内的蛋白质肉毒杆菌C3-外转移酶。
本发明的另一个实施方案包括通过有效量的药物组合物抑制血管生成，所述药物组合物包含细胞可渗透的融合蛋白缀合物，所述融合蛋白缀合物包含细胞膜转运蛋白多肽和肉毒杆菌保留ADP-核糖基转移酶活性的C3外转移酶部分或其功能类似物，例如融合蛋白如C3APLT。
在一个实施例中，本发明公开了一种治疗选自由黄斑变性、色素性视网膜炎、斯塔加特氏病、糖尿病性视网膜病、高血压性视网膜病和闭塞性视网膜病组成的组的眼病的方法，该方法包括向有需要的患者施用这种治疗有效量的药物组合物包含： a) 由 SEQ ID NO:43 组成的多肽，和； b) 药学上可接受的载体。在该实施例的一方面，背衬包括生物粘合剂。在该实施方案的一方面，载体包含纤维蛋白。在该实施方案的一个方面，施用包括注射。
在另一个实施方案中，本发明公开了一种治疗选自由黄斑变性、色素性视网膜炎、斯塔加特氏病、糖尿病性视网膜病、高血压性视网膜病和闭塞性视网膜病组成的组的眼病的方法，该方法包括向需要的患者施用治疗有效量的药物组合物包含：a)多肽，其包含共价连接至药物氨基酸序列的转运剂的氨基酸序列，其中药物的氨基酸序列由ADP-核糖基转移酶C3组成或其片段，它保留了 ADP-核糖基转移酶活性，其中转运蛋白的氨基酸序列通过受体非依赖性机制促进药物的摄取，并且选自 HIV Tat 蛋白的子域、同源域触角足和组氨酸标签，其中多肽具有ADP-核糖基转移酶活性，和； b) 药学上可接受的载体。在该实施方案的一方面，递送剂的氨基酸序列位于多肽的羧基末端，活性剂的氨基酸序列位于多肽的氨基末端。在该实施例的一方面，背衬包括生物粘合剂。在该实施方案的一方面，载体包含纤维蛋白。在该实施方案的一个方面，施用包括注射。
在另一个实施方案中，本发明公开了一种治疗选自由黄斑变性、色素性视网膜炎、斯塔加特氏病、糖尿病性视网膜病、高血压性视网膜病和闭塞性视网膜病组成的组的眼病的方法，该方法包括向需要的患者施用治疗有效量的药物组合物包含：a)多肽，其包含共价连接至药物氨基酸序列的转运剂的氨基酸序列，其中药物的氨基酸序列由ADP-核糖基转移酶C3组成或其片段，其保留ADP-核糖基转移酶活性，其中载体的氨基酸序列通过受体非依赖性机制促进药物摄取并且选自SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：26 ，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：47 和 SEQ ID NO：48，其中多肽具有 ADP-核糖基转移酶活性，并且； b) 药学上可接受的载体。在该实施方案的一方面，递送剂的氨基酸序列位于多肽的羧基末端，活性剂的氨基酸序列位于多肽的氨基末端。在该实施例的一方面，背衬包括生物粘合剂。在该实施方案的一方面，载体包含纤维蛋白。在该实施方案的一个方面，施用包括注射。
在另一个实施方案中，本发明公开了一种治疗选自由黄斑变性、色素性视网膜炎、斯塔加特氏病、糖尿病性视网膜病、高血压性视网膜病和闭塞性视网膜病组成的组的眼病的方法，该方法包括向需要的患者施用在这种治疗中，治疗有效量的药物组合物包含：a)包含共价连接至活性成分的氨基酸序列的转运剂的氨基酸序列的多肽，其中活性成分的氨基酸序列由ADP组成-核糖基转移酶C3或与SEQ ID NO:43的氨基酸序列具有至少90%序列同一性并保留ADP-核糖基转移酶活性的氨基酸序列，其中递送剂的氨基酸序列促进药物被受体非依赖性机制并且选自由HIV Tat蛋白的亚结构域、Antennapedia的同源结构域和组氨酸标签组成的组，其中该多肽具有ADP-核糖基转移酶活性，和； b) 药学上可接受的载体。在该实施例的一方面，背衬包括生物粘合剂。在该实施方案的一方面，载体包含纤维蛋白。在该实施方案的一个方面，施用包括注射。在该实施方案的一方面，递送剂的氨基酸序列位于多肽的羧基末端，活性剂的氨基酸序列位于多肽的氨基末端。
在另一个实施方案中，本发明公开了一种治疗选自由黄斑变性、色素性视网膜炎、斯塔加特氏病、糖尿病性视网膜病、高血压性视网膜病和闭塞性视网膜病组成的组的眼病的方法，该方法包括向需要的患者施用在这种治疗中，治疗有效量的药物组合物包含：a)包含共价连接至活性成分的氨基酸序列的转运剂的氨基酸序列的多肽，其中活性成分的氨基酸序列由ADP组成-核糖基转移酶C3或与SEQ ID NO:43的氨基酸序列具有至少90%序列同一性并保留ADP-核糖基转移酶活性的氨基酸序列，其中递送剂的氨基酸序列通过以下方式促进活性物质的摄取受体非依赖性机制并且选自由以下组成的组：SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO： NO：47和SEQ ID NO：48，和； b) 药学上可接受的载体。在该实施例的一方面，背衬包括生物粘合剂。在该实施方案的一方面，载体包含纤维蛋白。在该实施方案的一个方面，施用包括注射。在该实施方案的一方面，递送剂的氨基酸序列位于多肽的羧基末端，活性剂的氨基酸序列位于多肽的氨基末端。
在另一个实施方案中，本发明公开了一种抑制或显着降低视网膜下新生血管形成和新生血管组织增殖速率、防止玻璃膜疣沉积和保护视网膜光感受器免于细胞死亡（即降低玻璃膜疣沉积速率和降低视网膜速率）的方法。感光细胞死亡），包括向所述宿主施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含： a) 由 SEQ ID NO: 43 组成的多肽； b) 药学上可接受的载体。在该实施例的一方面，背衬包括生物粘合剂。在该实施方案的一方面，载体包含纤维蛋白。在该实施方案的一个方面，施用包括注射。
在另一个实施例中，本发明公开了一种抑制或显着降低视网膜下新生血管形成和新生血管组织增殖速率的方法，其防止玻璃膜疣沉积并保护视网膜光感受器免于细胞死亡（即降低玻璃膜疣沉积速率和降低视网膜光感受器）。哺乳动物宿主眼中的细胞死亡），包括向宿主施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含：a)包含与药物的氨基酸序列共价连接的转运剂的氨基酸序列的多肽，其中药物的氨基酸序列来自ADP-核糖基转移酶C3或其保留ADP-核糖基转移酶活性的片段，其中递送剂的氨基酸序列通过受体非依赖性机制促进药物的摄取并且选自由HIV Tat蛋白的一个子结构域、Antennapedia的一个同源结构域和一个组氨酸标签组成的组，其中该多肽具有ADP-核糖基转移酶活性，和； b) 药学上可接受的载体。
在该实施方案的一方面，递送剂的氨基酸序列位于多肽的羧基末端，活性剂的氨基酸序列位于多肽的氨基末端。在该实施例的一方面，背衬包括生物粘合剂。在该实施方案的一方面，载体包含纤维蛋白。在该实施方案的一个方面，施用包括注射。
在另一个实施方案中，本发明公开了一种抑制或显着降低视网膜下新生血管形成和新生血管组织增殖速率、防止玻璃膜疣沉积和保护视网膜光感受器免于细胞死亡（即降低玻璃膜疣沉积速率和降低视网膜速率）的方法。哺乳动物宿主眼中的光感受器细胞死亡），包括向宿主施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含：a)包含共价连接至药物的氨基酸序列的转运剂的氨基酸序列的多肽，其中药物的氨基酸序列由ADP-核糖基转移酶C3或其保留ADP-核糖基转移酶活性的片段组成，其中递送剂的氨基酸序列通过受体非依赖性机制促进药物摄取并且选自SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47 和 SEQ ID NO: 48，其中多肽具有ADP-核糖基转移酶活性，并且； b) 药学上可接受的载体。在该实施方案的一方面，递送剂的氨基酸序列位于多肽的羧基末端，活性剂的氨基酸序列位于多肽的氨基末端。在该实施例的一方面，背衬包括生物粘合剂。在该实施方案的一方面，载体包含纤维蛋白。在该实施方案的一个方面，施用包括注射。
在另一个实施方案中，本发明公开了一种抑制或显着降低视网膜下新生血管形成和新生血管组织增殖速率、防止玻璃膜疣沉积和保护视网膜光感受器免于细胞死亡（即降低玻璃膜疣沉积速率和降低视网膜速率）的方法。哺乳动物宿主眼中的感光细胞死亡），包括向宿主施用治疗有效量的药物组合物，该药物组合物包含：物质，活性物质的氨基酸序列来自ADP-核糖基转移酶C3或与SEQ ID NO：43的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列，并且该氨基酸的ADP-核糖基转移酶活性保留[0302] 通过受体非依赖性机制促进活性物质摄取的转运剂的序列选自HIV Tat蛋白的子结构域、Antennapedia的同源结构域和组氨酸标签，其中多肽具有ADP-核糖基转移酶活性和； b) 药学上可接受的载体。在该实施例的一方面，背衬包括生物粘合剂。在该实施方案的一方面，载体包含纤维蛋白。在该实施方案的一个方面，施用包括注射。在该实施方案的一方面，递送剂的氨基酸序列位于多肽的羧基末端，活性剂的氨基酸序列位于多肽的氨基末端。
在另一个实施方案中，本发明公开了一种抑制或显着降低视网膜下新生血管形成和新生血管组织增殖速率、防止玻璃膜疣沉积和保护视网膜光感受器免于细胞死亡（即降低玻璃膜疣沉积速率和降低视网膜速率）的方法。哺乳动物宿主眼中的感光细胞死亡），包括向宿主施用治疗有效量的药物组合物，该药物组合物包含：物质，活性物质的氨基酸序列来自ADP-核糖基转移酶C3或与SEQ ID NO：43的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列，并且该氨基酸的ADP-核糖基转移酶活性保留促进通过受体非依赖性机制摄取活性物质的转运剂的序列并且选自由以下组成的组：SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO： 44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47 和 SEQ ID NO：48，和； b) 药学上可接受的载体。在该实施例的一方面，背衬包括生物粘合剂。在该实施方案的一方面，载体包含纤维蛋白。在该实施方案的一个方面，施用包括注射。在该实施方案的一方面，递送剂的氨基酸序列位于多肽的羧基末端，活性剂的氨基酸序列位于多肽的氨基末端。
一方面，本发明多肽的治疗有效量是将黄斑近端新血管形成的进程延缓至少 90%、优选至少 50%、更优选至少在未治疗的患者或治疗的患者中在黄斑近端观察到的新生血管形成率的至少 10%，更优选至少 1%，最优选至少 0.1% 的比率载体，例如不含本发明多肽的本发明药物组合物。
另一方面，本发明多肽的治疗有效量是能够延迟或抑制玻璃膜疣在统计相关患者群体中平均患者眼睛中的沉积速率以产生视力发作的平均延迟的量可能由沉积引起的丧失，其中视力丧失发作的平均延迟是相对于在统计学上相关的患者群体中没有多肽量的普通患者中发生的视力丧失发作的平均时间来测量的，平均延迟视力丧失的发作包括至少1个月的时期，更优选至少6个月的时期，最优选超过6个月的时期。
在另一个方面，本发明多肽的治疗有效量是可以延迟或抑制统计相关患者群体中普通患者眼睛中感光细胞死亡的进程（或速率）以产生平均延迟的量可能由细胞死亡引起的视力丧失的发作，其中视力丧失发作的平均延迟是相对于缺乏多肽量的统计相关患者群体中的普通患者视力丧失发作的平均时间来测量的，其中视力丧失开始的平均延迟包括至少1个月的时间，更优选至少6个月的时间，最优选超过6个月的时间。
另一方面，本发明多肽的治疗有效量是能够延迟或抑制玻璃膜疣沉积速率和延迟或抑制普通患者眼中细胞死亡进程（或速率）的量。统计相关的患者群体，以产生可能由沉积和细胞死亡引起的视力丧失发作的平均延迟，相对于统计学上普通患者视力丧失发作的平均时间测量发作的平均延迟在缺乏一定量多肽的相关患者群体中，视力丧失发作的平均延迟包括至少 1 个月的时间，更优选至少 6 个月的时间，最优选大于 6 个月的时间个月。
本发明化合物或组合物的治疗有效量或剂量可指给药时产生所需结果的量。治疗有效量或剂量可取决于许多因素，包括给药途径。
和---关联
和---关联
和---关联
转向
如你看到的
和---关联
和---关联
和---关联
和---关联
和---关联
和---关联
和---关联
因此，一方面，本发明包括治疗选自黄斑变性、色素性视网膜炎、斯塔加特氏病、糖尿病性视网膜病、高血压性视网膜病和闭塞性视网膜病的眼病的方法，该方法包括给患者施用，需要这种治疗时，治疗有效量的药物组合物包含：
- a)包含与药物的氨基酸序列共价连接的转运剂的氨基酸序列的多肽，其中药物的氨基酸序列由ADP-核糖基转移酶C3或其保留ADP-核糖基转移酶活性的片段组成，其中递送剂的氨基酸序列通过受体非依赖性机制促进药物摄取，并且选自由HIV Tat蛋白的子结构域、Antennapedia的同源结构域和组氨酸标签组成的组，其中多肽具有ADP-核糖基转移酶活性和;
- b) 药学上可接受的载体。
另一方面，本发明包括一种抑制或显着降低哺乳动物宿主眼中视网膜下新生血管形成和新生血管组织增殖速率的方法，包括向宿主施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含：
- a) a) 包含与药物的氨基酸序列共价连接的转运剂的氨基酸序列的多肽，其中药物的氨基酸序列由ADP-核糖基转移酶C3或其具有ADP-核糖基转移酶活性的片段组成，其中载体的氨基酸序列通过受体非依赖性机制促进药物摄取，并且选自由HIV Tat蛋白的亚结构域、Antennapedia的同源结构域和组氨酸标签组成的组，所述多肽具有ADP-核糖基转移酶活性和;
- b) b) 药学上可接受的载体。
和---关联
和---关联
C3-07 显示 ADP-核糖基化活性，而 C3-07Q189A 在 ADP-核糖基化活性方面有意失活。
将包含本发明的融合蛋白的药物组合物施用于需要治疗选自黄斑变性、色素性视网膜炎、斯塔加特氏病、糖尿病性视网膜病、高血压性视网膜病和闭塞性视网膜病的眼病的患者可以实质上减少或预防哺乳动物宿主眼睛中与视网膜下新生血管形成、黄斑下脉络膜新生血管形成和黄斑近端视网膜下脉络膜新生血管组织增生相关的血管生成，并且包括治疗选自以下的选定的一种眼睛疾病的方法由黄斑变性、色素性视网膜炎、斯塔加特病、糖尿病性视网膜病、高血压性视网膜病和闭塞性视网膜病组成的组。一方面，本发明的组合物可用于抑制或显着降低与选自黄斑变性、视网膜色素变性、斯塔加特氏病、糖尿病性视网膜病、高血压性视网膜病变和闭塞性视网膜病变。该方法可用作预防性治疗以防止黄斑变性在眼睛中的进一步发作或进展，所述黄斑变性表现出选自由黄斑变性、色素性视网膜炎、斯塔加特氏病、糖尿病性视网膜病、高血压性视网膜病、和闭塞性视网膜病变。另一方面，该方法可用作预防性治疗以防止玻璃膜疣沉积和黄斑中的细胞死亡。在另一方面，该方法可以通过影响调节细胞死亡的细胞内机制来防止患者眼睛中感光细胞（感光细胞在本文中也称为光感受器）的死亡。该方法还可用于预防未表现出视力受损的黄斑变性症状的眼睛中黄斑变性的发作或进展，特别是在其另一只眼睛表现出视力受损的黄斑变性症状的患者的眼睛中。
在本发明的另一个方面，一种治疗选自黄斑变性、色素性视网膜炎、斯塔加特氏病、糖尿病性视网膜病、高血压性视网膜病和闭塞性视网膜病的眼病的方法，例如通过注射或植入组织给药将治疗有效量的本发明的多肽或适合注射给药的本发明的无菌药物组合物靠近眼睛，所述组合物包含本发明的多肽和适合注射使用的载体（例如无菌的、可灭菌的）。并且与血液等渗），其中多肽或药物组合物能够预防或延迟与由视网膜下新血管形成、黄斑下脉络膜新血管形成和黄斑近端视网膜下脉络膜中新血管组织增生相关的血管生成的发生是统计相关患者群体中平均患者的眼睛产生可能由血管生成引起的视力丧失发作的平均延迟，相对于发生视力丧失的平均发作时间的平均发作延迟是在普通患者中测量的在不存在一定量多肽的统计相关患者群体中，视力丧失发作的平均延迟包括至少1个月的时间，更优选至少6个月的时间，最优选更长时间的时间超过6个月。
可以在体外系统中评价包含本发明的融合蛋白例如C3APLT的药物组合物对血管生成的抑制，这也可用于研究肿瘤生长过程中的血管生成，即。 H。描述了一种系统，该系统涉及在基底膜提取物 (Matrigel™) 存在的情况下培养内皮细胞，作为哺乳动物眼中血管生成和新生血管形成和新生血管组织增殖的模型。在实验观察条件下，可以在显微镜下观察到与血管生成或血管毛细血管形成相关的毛细血管样结构或小管。本发明的融合蛋白，如 C3APLT，对血管生成的进程或对管状毛细血管网络的形成或对肿瘤相关血管生成过程或进程的破坏的抑制作用可以通过以下观察来观察基质胶测定中管状血管生成结构的分析。
Matrigel™ Matrix (BD Biosciences) 是一种从 EHS 小鼠肉瘤（一种富含 ECM 蛋白的肿瘤）中提取的可溶性基底膜制剂。其主要成分为层粘连蛋白、IV型胶原蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白多糖和巢蛋白。在室温下，BD Matrigel™ Matrix 聚合成一种具有生物活性的基质材料，可以模拟哺乳动物的细胞基底膜，使细胞在体外表现类似于体内条件。 Matrigel™ Matrix 可为细胞形态学、生化功能、迁移或侵袭以及基因表达的研究提供生理相关环境。
在 Matrigel 测定中，Matrigel（约 12.5 mg/mL）在约 4°C 下解冻。将基质（约 50 微升 (µL)）添加到 96 孔板的每个孔中，并使其在约 37°C 下固化约 10 分钟。含有固体 Matrigel 的孔与人脐静脉内皮 (HUVEC) 细胞以每孔约 15,000 个细胞的浓度孵育约 30 分钟。当细胞贴壁时，除去培养基并用补充有本发明的融合蛋白如C3APLT的新鲜培养基替换，并在37℃下孵育约6至约8小时。对照孔仅用培养基孵育。可以在例如约 50 倍的放大倍率下通过显微镜观察管道以分析生长。在包含本发明的融合蛋白x的药物组合物的评估中观察到的血管生成衍生的毛细管网络的相对平均长度Yx可以根据说明书使用Northern Eclipse软件进行量化。
来自典型的 Matrigel 测定实验的数据总结在表 3 中，该实验涉及例如包含命名为 C3APLT 的融合蛋白的药物组合物对血管生成衍生的毛细血管网络的长度的影响。这些数据表明，与对照载体产生的抑制相比，在所用剂量和制剂条件下网络形成被抑制约13％至约20％，没有抑制提供100％的生长。这种对血管生成的影响可以通过使用更高剂量的融合蛋白和通过在将细胞添加到 Matrigel 之前将 HUVEC 细胞与融合蛋白 C3APLT 预孵育来增强。包含本发明的多肽的组合物的抗血管生成作用，所述多肽包含共价连接至活性剂的氨基酸序列的转运剂的氨基酸序列，其中活性剂的氨基酸序列含有ADP-核糖基转移酶活性，可以当根据本发明的方法将组合物施用于哺乳动物时，可用于抑制或显着减少哺乳动物宿主眼中视网膜下新生血管形成和新生血管组织的增殖。
有利的是，本发明提供包含本发明融合蛋白的组合物，其中融合蛋白在施用于哺乳动物后，优选靠近眼睛或施用于向眼供血的血管中，具有内皮细胞的能力在没有融合蛋白的情况下，侵入眼中的细胞可以形成新的血管。因此，当施用于哺乳动物的眼睛时，本发明的组合物可以抑制或显着降低哺乳动物眼睛中视网膜下新生血管形成和新生血管组织增殖的速率。
一种研究融合蛋白在眼睛中的神经保护作用的系统是视轴索切断术模型。在视觉系统中，视神经损伤后视网膜神经节细胞死亡，细胞死亡的严重程度和速度取决于轴突损伤与眼睛的距离。在大鼠中，眼睛附近视神经的横断会导致延迟的 RGC 死亡，细胞在轴突切开术后约 4 天开始死亡。已经很好地证明，对阻止细胞死亡的因素进行干预会导致部分和短暂的细胞挽救。眼内注射生长因子，包括 BDNF、NT4、GDNF、CNTF 和 FGF，可以挽救 RGC 免于轴突切开术诱导的细胞死亡。其他拯救细胞的方法是干扰导致凋亡细胞死亡的酶。诱导巨噬细胞活化的晶状体损伤和从酵母细胞壁注射酵母聚糖可促进 RGC 的存活。为了研究 Rho 失活对 RGC 存活的影响，在轴突切开术后将 C3-07 注射到玻璃体中：为了将 C3-07 对 Rho 激活的影响与玻璃体内注射蛋白质可能引起的炎症反应分开，我们使用了一种故意失活的突变体C3-07 蛋白质，i。 H。 C3-07Q189A 缺乏 ADP-核糖基化活性但保留正常的糖水解活性。据我们所知，这是第一个使用突变的 C3 胞外酶或 C3 融合蛋白来研究视网膜细胞存活的体内研究。我们发现单次注射 C3-APLT 或 C3-07 以报告的 BDNF 速率促进 RGC 的存活，并且 C3-07 的作用取决于其灭活 Rho 的能力。
其他动物模型可用于评估感光细胞损伤和拯救（例如，降低感光细胞死亡率）。小鼠视网膜退化和其他眼病的遗传模型很有用。光感受器拯救可以在患有遗传性视网膜变性的 RCS 大鼠或表达突变形式的视紫红质的转基因小鼠系中证明，这些突变形式会导致人类视网膜色素变性。这种小鼠可从 Jackson Labs 购得。视网膜脱离也会导致感光细胞死亡，这提供了另一种动物模型来证明神经保护作用（例如，降低感光细胞死亡率）。动物模型也用于评估化合物对湿性黄斑变性和相关疾病中发生的新血管形成的影响。新生儿啮齿动物氧诱导视网膜病变的啮齿动物模型，有时称为早产儿视网膜病变 (ROP)，可用于模拟视网膜新生血管形成。
C3APL 是通过连接编码 C3 的 cDNA（Dillon 和 Feig (1995) 256:174-184）与编码 Antennapedia 同源域的 cDNA（Bloch-Gallego (1993) 120:485-492）获得的蛋白质的名称。使用引物（寡核苷酸）5'GAA TTC TTT AGG ATT GAT AGC TGT GCC 3'（SEQ ID NO：1），通过聚合酶链反应（PCR），DNA 3' 末端的终止密码子被 EcoRI 位点终止和 5'GGT GGC GAC CAT CCT CCA AAA 3'（SEQ ID NO：2）。将 PCR 产物亚克隆到 pSTBlue-1 载体（Novagen，City）中，然后使用 BamHI 和 NotI 限制位点克隆到 pGEX-4T 载体中。该载体被命名为 pGEX-4T/C3。用于添加到 pGEX-4T/C3 中 C3 的 3' 端的 Antennapedia 序列是通过 PCR 从 pET-3a 载体生成的（Bloch-Gallego (1993) 120:485-492, Derossi (1994) 269 : 10444- 10450) 亚克隆到平端 pSTBlue-1 载体中，然后使用限制位点 EcoR I 和 Sal I 克隆到 pGEX-4T/C3，创建 pGEX-4T/C3APL。选择另一个具有移码突变的克隆 (C3APLT) 并生产和测试蛋白质。尽管存在突变，当培养物检测呈阳性时，该克隆由另一家公司重新测序以确认该突变，并将该克隆命名为 C3APLT。为了确认 C3APLT 的序列，对两条链的编码序列进行了测序。该克隆的序列在实施例16和17中给出（C3APLT的核苷酸序列；SEQ ID NO：42，C3APLT的氨基酸序列；SEQ ID NO：43）。
还创建了 Antennapedia (pGEX-4T/C3APS) 的较短版本。该嵌合序列通过将编码短 Antennapedia 肽（Maizel（1999）126：3183-3190）的寡核苷酸连接到 EcoRI 和 SalI 切割的 pGEX-4T/C3 载体中来构建。将重组的C3APLT和C3APS cDNA分别转化到细菌中，产生重组蛋白后，超声得到细菌匀浆，匀浆离心澄清。将谷胱甘肽-琼脂糖珠 (Sigma) 添加到澄清的裂解物中并置于旋转板上 2-3 小时，然后彻底清洗。为了从重组蛋白中去除谷胱甘肽-S-转移酶序列，添加了 20 U（单位）的凝血酶，将珠子留在旋转器上 4°C 过夜。用凝血酶消化后，将珠子装入空的 20 ml 柱中，并用 PBS（磷酸盐缓冲盐水）洗脱蛋白质。合并含有重组蛋白的等分试样，加入 100 µl 对氨基苯甲脒琼脂糖珠 (Sigma)，并在 4°C 下混合 45 分钟以去除凝血酶，然后通过离心分离从珠中去除重组蛋白。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 确定样品的纯度，并使用 PC-12 细胞进行生物活性生物测定（参见 Lehmann 等人，同上）。
产生生物活性嵌合蛋白的其他可能方法包括阴离子交换层析。不需要 GST 标签，可以将其移除。然后可以将 cDNA 克隆到高表达细菌载体中，如实施例 16 中给出的 pET。
Rho拮抗剂是一种重组蛋白，可以通过本领域已知的方法生产。本发明的蛋白质可以从细菌细胞提取物或通过使用重组技术通过用全部或部分C3编码DNA片段转化、转染或感染宿主细胞来产生，该片段在合适的表达载体。分子生物学领域的技术人员将理解可以使用多种表达系统中的任何一种来提供重组蛋白。所用的精确宿主细胞对本发明并不重要。
每种融合蛋白都可以使用亲和纯化技术或更传统的柱色谱法轻松纯化。亲和技术包括但不限于 GST（谷胱甘肽 S-转移酶）或使用对表达的融合蛋白具有特异性的抗体或使用组氨酸标签。或者，重组蛋白可以与免疫球蛋白 Fc 结构域融合。这种融合蛋白可以很容易地使用蛋白 A 柱进行纯化。上述拮抗剂的小分子模拟物也包括在本发明中。
为了测试 C3APLT、C3APS、C3-TL 和 C3-TS 的有效性，使用 PC-12 细胞进行了一系列实验，PC-12 细胞是一种在生长抑制基质上生长的神经细胞系（参见 Lehmann 等人，同上）。如所述（Lehmann 等人，同上）将 PC-12 细胞接种在髓磷脂基质上。 C3、C3APLT、C3APS、C3-TL 或 C3-TS 以不同浓度添加，无需研磨（参见
还在 0.25 ng/mL、2.5 ng/mL、25 ng/mL、250 ng/mL 和 2.5 μg/mL（2.5 微克/毫升）和 25 μg/mL（ 25 微克/毫升），并被发现能够在远低于 C3 的剂量下促进髓鞘基质上的神经突生长（
为验证 C3APLT 和 C3APS 促进原代神经元生长的能力，制备原代视网膜培养物并将神经元接种到髓磷脂基质上，如关于实施例 5 所述。未经 C3APLT 或 C3APS 处理，细胞保持圆形且无法生长神经突。当用 C3APLT 或 C3APS 处理时，视网膜神经元能够在抑制性髓鞘底物上扩展长轴突（
接下来，测试了 C3APLT 和 C3APS 在与神经胶质疤痕上发现的生长抑制蛋白类型相关的另一种生长抑制底物上促进生长的能力。腔室载玻片涂有硫酸软骨素蛋白多糖 (Chemicon) 的混合物，然后涂上视网膜神经元（结果显示在
检测C3APLT促进脊髓损伤后再生和功能恢复的能力
为了测试 C3APLT 是否可以促进脊髓损伤后的修复，使用完全成年小鼠（如关于实施例 6 所述）。在 T8（胸椎第 8 级）处进行背侧半切，小鼠接受不同量的处理（
行为测试在手术和应用 C3APLT 后的第二天开始。动物被放置在由大约 4 英尺乘 3 英尺大小的橡胶垫组成的开阔场地环境中。允许动物随机移动，将动物的移动记录在视频上。对于每项测试，两名观察员都会对动物在恢复早期活动脚踝、膝盖和髋关节的能力进行评分。先前观察到，C3 治疗小鼠导致功能恢复，治疗后 24 小时可观察到。早在接受 C3APLT 治疗的小鼠脊髓损伤后 24 小时就观察到了功能恢复（
录像带的定性观察表明，只有接受 C3APLT 的动物在治疗 30 天后才达到后期恢复。未经处理的对照动物通常不会超过恢复的早期阶段。这些结果表明，与不治疗、单独损伤或单独使用纤维蛋白胶相比，使用 C3APLT 改善了脊髓损伤后的长期功能恢复。
为了测试早期恢复是否是由于神经保护作用，根据制造商的说明（Roche Diagnostic）通过 tunel 标记检查脊髓切片的细胞凋亡。 C3APLT 能够减少在病变部位观察到的死亡细胞数量。因此，C3APLT 应该是治疗缺血（例如中风后）的有效神经保护剂。
据报道，Antennapedia 运输序列的长版本可以增加神经突长出（Bloch-Gallego, E., LeRoux, I.-, Joliot, AH, Volovitch, M., Henderson, CE, Prochiantz, A. 1993）。 J Cell Biol. 120:485)。因此，预计该序列会增强神经突的生长。对于下面给出的序列，起始位点位于质粒的 GST 序列中（未显示）。带有 GST 序列的载体是可商购的，因此包括起始点在内的整个 GST 序列未被测序。仅应确定从 GST 序列释放 C3 缀合物的凝血酶切割位点的 3' 序列。 GST 序列用凝血酶切割。
APL转运序列(SEQ ID NO.：44)如下：
C3APL的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)
C3APL的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)
C3APL 的物理性质
- 分子量 34098.03 道尔顿
- 295个氨基酸
- 48 种强碱性 (+) 氨基酸 (K,R)
- 28 种强酸性 (−) 氨基酸 (D,E)
- 89 个疏水性氨基酸（A、I、L、F、W、V）
- 94种极性氨基酸（N、C、Q、S、T、Y）
- 9.847等电点
- 在 PH 7.0 时充电 20,524
- Davis、Botstein、Roth 熔化温度 C. 79.48
C3APS的核苷酸序列(SEQ ID NO：5)。起始位点位于质粒的 GST 序列中，此处未显示。
APS转运序列(SEQ ID NO.：45)如下：
C3APS 的氨基酸序列（SEQ ID NO：6）
C3APS 的物理性质
- 分子量 29088.22 道尔顿
- 257个氨基酸
- 38 种强碱性 (+) 氨基酸 (K,R)
- 23 种强酸性 (−) 氨基酸 (D,E)
- 79 个疏水性氨基酸（A、I、L、F、W、V）
- 83种极性氨基酸（N、C、Q、S、T、Y）
- 9.745 等电点
- PH 7.0 时充电 15,211
- Davis、Botstein、Roth 熔化温度 C. 78.34
C3APL（氨基酸序列：SEQ ID NO：4）和 C3APLT（氨基酸序列；SEQ ID NO：37）是由通过连接 C3 转移酶的功能域和同源框区域获得的 cDNA 编码的蛋白质的名称称为 Antennapedia 的转录因子 (Bloch-Gallego (1993) 120:485-492) 以下列方式。克隆到质粒载体 pGEX-2T 中的编码 C3（Dillon 和 Feig（1995）256：174-184）的 cDNA 用于嵌合蛋白的 C3 部分。使用引物 5'GAA TTC TTT AGG ATT GAT AGC TGT GCC 3' (SEQ ID NO:1) 和 5'GGT GGC，通过聚合酶链反应将 DNA 3' 末端的终止密码子替换为 EcoRI 位点GAC CAT CCT CCA AAA 3' (SEQ ID NO:2)。将 PCR 产物亚克隆到 pSTBlue-1 载体（Novagen，City）中，然后使用 BamHI 和 NotI 限制位点克隆到 pGEX-4T 载体中。该载体被命名为 pGEX-4T/C3。 pGEX-4T 载体具有用于亲和纯化的 5'-谷胱甘肽-S-转移酶 (GST) 序列。用于添加到 pGEX-4T/C3 中 C3 的 3' 端的 Antennapedia 序列是通过 PCR 从 pET-3a 载体生成的（Bloch-Gallego (1993) 120:485-492, Derossi (1994) 269 : 10444- 10450）。使用的引物是 5'GAA TCC CGC AAA CGC GCA AGG CAG 3'（SEQ ID NO：7）和 5'TCA GTT CTC CTT CTT CCA CTT CAT GCG 3'（SEQ ID NO：8）。将从反应中获得的 PCR 产物亚克隆到平端 pSTBlue-1 载体中，然后使用限制位点 EcoRI 和 SalI 克隆到 pGEX-4T/C3 中，生成 pGEX-4T/C3APL 和 C3APLT。选择 C3APLT 是因为存在移码突变，导致富含脯氨酸的转运区单位。
还制备了更短版本的 Antennapedia (pGEX-4T/C3AP-short)（C3APS 的氨基酸序列；SEQ ID NO：6）。该嵌合序列通过将编码短 Antennapedia 肽（Maizel（1999）126：3183-3190）的寡核苷酸连接到 EcoRI 和 SalI 切割的 pGEX-4T/C3 载体中来构建。对于 pGEX-4T/C3AP，所制备寡核苷酸的短序列为 5'AAT TCC GCC AGA TCA AGA TTT GGT TCC AGA ATC GTC GCA TGA AGT GGA AGA AGG 3' (SEQ ID NO: 9) 和 5'GGC GGT CTA GTT CTA AAC CAA GCT CTT AGC AGC GTA GTT CAC CTT CTT CCA GCT 3' (SEQ ID NO: 10)。两条链通过混合等量的寡核苷酸退火，加热至 72°C 5 分钟，然后在室温下放置 15 分钟。将寡核苷酸连接到 pGEX4T/C3 载体中，挑选并分析克隆。
为生产重组 C3APLT (SEQ ID NO.: 37) 和 C3APS (SEQ ID NO.: 6) 蛋白，将含有相应 cDNA 的质粒（pGEX-4T/C3APLT 和 pGEX-4T/C3AP-short）转化到细菌中, 菌株 XL-1 蓝色主管大肠杆菌.细菌在含有 50 µg/ml 氨苄青霉素 (BMC-Roche) 的 L 肉汤（10 g/l 细菌胰蛋白胨、5 g/l 酵母提取物、10 g/l NaCl）中在振荡培养箱中于37° C 和 300 rpm。添加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 (IPTG) (Gibco) 至终浓度为 0.5 mM 以诱导重组蛋白的产生，并在 37°C 和 250 U /min 下继续培养 6 小时。通过在 250 ml 离心瓶中在 4°C 下以 7000 rpm 离心 6 分钟获得细菌沉淀。将每个沉淀物悬浮在 10 ml 缓冲液 A（50mM Tris，pH 7.5，50mM NaCl，5mM MgCl 2 ，1mM DTT）加 1mM PMSF 中。将所有重新悬浮的颗粒汇集并转移到冰上的 100 mL 塑料烧杯中。将剩余的含有 PMSF 的缓冲液 A 添加到混合样品中。使用 Branson Sonifier 450 探头超声仪对细菌样品进行 6 x 20 秒的超声处理。在超声处理之间，细菌和探针都在冰上冷却 1 分钟。将超声产物在 Sorvall SS-34 转子中以 16,000 rpm 在 4°C 下离心 12 分钟以清除上清液。将上清液转移至新鲜的 SS-34 管中，并在 4°C 下以 12,000 rpm 的转速重新离心 12 分钟。将多达 20 毫升的谷胱甘肽-琼脂糖珠 (Sigma) 添加到澄清的裂解物中，并放置在旋转板上 2-3 小时。珠子用缓冲液 B（缓冲液 A，NaCl 为 150mM，无 PSMF）洗涤 4 次，然后用缓冲液 C（缓冲液 B + 2.5mM CaCl 2 ）洗涤 2 次。倒出最终的洗涤溶液，直到珠子形成粘稠的浆液。为了从重组蛋白中去除谷胱甘肽-S-转移酶序列，添加了 20 U 凝血酶（牛，无纤溶酶原，Calbiochem），将珠子留在旋转器上 4°C 过夜。用凝血酶切割后，将珠子装入空的 20 ml 柱中。通过用 PBS 洗脱收集大约 20 个 1 ml 的等分试样。将每 0.5 µl 等分试样的样品点样到硝酸纤维素上，并用氨基黑染色以确定蛋白质峰。合并含有融合蛋白的等分试样，加入 100 微升（100 微升）对氨基苯甲脒琼脂糖珠（Sigma），并在 4°C 下混合 45 分钟。这最后一步从重组蛋白样品中去除了凝血酶。将重组蛋白离心以去除珠子，然后使用 Centriprep-10 浓缩器 (Amicon) 浓缩。浓缩的重组蛋白用 PD-10 柱（含有 Sephadex G-25M 的 Pharmacia）脱盐并收集 10 个 0.5 ml 等分试样。将这些样品进行斑点印迹以确定蛋白质峰，并将适当的等分试样合并、过滤除菌并储存在-80°C。使用蛋白质测定法（DC-Assay，Biorad）来确定重组蛋白的浓度。样品的纯度通过 SDS-PAGE 和使用 PC-12 细胞的生物活性生物测定来确定。
为了测试 C3APLT 和 C3APS 克服生长抑制的能力，将 PC-12 细胞接种在髓磷脂（一种生长抑制底物）上。髓磷脂已从牛脑中纯化出来（Norton 和 Poduslo (1973) 21:749-757）。在一些其他实验中，硫酸软骨素蛋白聚糖 (CSPG) 底物由购买的蛋白质组合物 (Chemicon) 制备。在覆盖盖玻片或 96 孔板的孔之前，将它们涂上聚-L-赖氨酸（0.025 微克/毫升；0.025 微克/毫升）（Sigma，圣路易斯，密苏里州），用水清洗并平静地干燥。在 -80°C 下以 1 mg/mL 溶液形式储存的髓磷脂在 37°C 下解冻并涡旋。在 Lab-Tek 8 孔载玻片（Nuc，Naperville，Illinois）中以 8 µg/孔接种髓磷脂。髓磷脂溶液在无菌组织培养罩中干燥过夜。第二天早上，用磷酸盐缓冲盐水轻轻洗涤底物，然后将培养基中的细胞加入底物中。 PC-12 细胞（Lehmann 等人，1999）在含有 10% 马血清 (HS) 和 5% 胎牛血清 (FBS) 的 DMEM 中生长。使用前两天，PC-12 细胞通过 50 ng/ml 神经生长因子 (NGF) 进行分化。引发细胞后，将 5 ml 胰蛋白酶添加到培养皿中以分离细胞，将细胞沉淀并重悬于 2 ml 含 1% H2S 和 50 ng/ml 神经生长因子的 DMEM 中。然后将大约 5000-7000 个细胞接种到髓磷脂包被的 8 孔 Lab-Tek 载玻片（Nuc，Naperville，Illinois）上。将细胞在 37°C 下放置在测试基底上 3-4 小时，以使细胞沉降。通过抽吸小心去除原始培养基，注意不要破坏细胞，并用含有 1% HS、50 ng/ml NGF 和不同量的 C3、C3APLT 或 C3APS 的 DMEM 代替，具体取决于所需剂量。两天后，固定细胞（4% 多聚甲醛和 0.5% 戊二醛）。对于使用未修饰的 C3 的对照实验，NGF 引发的 PC-12 细胞被胰蛋白酶消化以将它们从培养皿中分离出来，细胞用划痕加载缓冲液（114 mM KCL、15 mM NaCl、5.5 mM MgCl 2 和 10 mM三）洗净。 HCL)，然后在 0.5 ml 划痕缓冲液中含有 25 或 50 µg/ml（微克/毫升）C3 的情况下用橡皮刮刀刮下细胞。接种前将细胞沉淀并重悬于 2 ml DMEM、1% HS 和 50 ng/ml 神经生长因子中。每种处理至少分析了四个实验。每口井以 20 倍放大倍数拍摄十二张图像。使用 Zeiss Axiovert 显微镜的物镜。对于每个图像，计算有和没有神经突的细胞数量，并确定神经突的长度。因为髓磷脂是相致密的，所以在分析之前用抗βIII-微管蛋白抗体对接种在髓磷脂基质上的细胞进行免疫染色。使用 Northern Eclipse 软件（Empix Imaging，Mississauga，Ontario，Canada）对神经突生长进行定量分析。使用 Microsoft Excel 进行数据分析和统计。
对于快速生物测定，如上所述在组织培养中测试化合物，不同的是将细胞接种在组织培养塑料而不是抑制性底物上。对于这些实验，固定板并在细胞铺板后 5 小时计数神经突。与未经处理的铺板细胞相比，测试化合物（C3APLT 和 C3Basic3）能够促进组织培养塑料上更快的生长（
为了研究 C3、C3APLT 和 C3APS 对 ADP 的核糖基化作用，如上所述将化合物添加到 PC-12 细胞培养物中。通过离心收集细胞，制备细胞匀浆，并通过 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质。然后将蛋白质转移到硝酸纤维素上，并用抗 RhoA 抗体 (Santa Cruz) 检测蛋白质印迹。
如实施例4中所述制备髓磷脂底物并铺板到组织培养室载玻片上。将 P1 至 P3 大鼠幼崽斩首，用乙醇清洗头部，取出眼睛并放入装有 Hanks 缓冲盐水（HBSS，来自 Gibco）的培养皿中。在角膜上切开一个洞，取出晶状体，并推出视网膜。通常，每次准备使用四个视网膜。将视网膜移入 15 ml 试管中并将体积调至 7 ml。添加另外的7ml解离酶和木瓜蛋白酶。解离酶溶液配制如下：将30 mg DL-半胱氨酸置于15 ml试管（Sigma DL-半胱氨酸盐酸盐）和70 ml HBSS中，加入280 μl 10 mg/ml牛血清白蛋白，混合溶液并测定 pH，用 0.3 N NaOH 调节至 7。将解离的溶液过滤除菌并以 7 ml 等分试样冷冻保存，并在使用前添加 12.5 单位/ml 木瓜蛋白酶 (Worthington)。将解离溶液加入视网膜后，将管在 37°C 的摇床上孵育 30 分钟。然后将视网膜轻轻研磨、离心并用 HBSS 清洗。在存在或不存在 C3APLT 或 C3APS 的情况下，将 HBSS 替换为生长培养基（DMEM（Gibco））、10% 胎牛血清和 50 ng/ml 脑源性神经营养因子 (BDNF) 维生素、青霉素-链霉素。在如上文实施例4中所述制备的室载玻片中的髓磷脂或CSPG测试底物上铺板如上文实施例4所述进行定量分析通过荧光显微术用抗βIII微管蛋白抗体观察神经元，其检测视网膜神经节细胞(RGCs)的生长) 结果显示在
成年 Balb-c 小鼠用 0.6 ml/kg Hypnorm、2.5 mg/kg 地西泮和 35 mg/kg 氯胺酮麻醉。这导致大约 30 分钟的麻醉，足以完成整个手术。通过使用显微咬骨钳 (Fine Science Tools) 移除椎骨和棘突来暴露一段胸椎。然后在背侧做脊髓损伤，用细剪刀延伸超过中央管，并用细刀重新切割损伤。这种损伤使所有对照动物截瘫。椎旁肌用可吸收缝线缝合，皮肤用 2.0 丝线缝合。手术后，每 8-10 小时人工排空膀胱，直到动物恢复控制，通常需要 2-3 天。食物放在笼子里以方便取用，并使用海绵水以方便手术后取水。此外，动物在前 3 天每 8-12 小时皮下注射一次丁丙诺啡 (0.05 至 0.1 mg/kg)。处死体重减轻 15-20% 的所有动物。
Rho 拮抗剂（C3 或 C3 样蛋白）通过基于纤维蛋白的组织胶递送系统（McKerracher，加拿大专利申请号 2,325,842）局部递送至损伤部位。在 CaCl2 存在下，将重组 C3APLT 与纤维蛋白原和凝血酶混合。纤维蛋白原被凝血酶裂解，所得纤维蛋白单体聚合成三维基质。我们添加了 C3APLT 作为纤维蛋白胶的一部分，该胶在放入受伤的脊髓后约 10 秒内聚合。我们测试了在脊髓损伤发生后应用于脊髓损伤部位的 C3APLT。作为对照，我们仅注射纤维蛋白胶或剪断脐带而不进行进一步处理。对于行为测试，BBB 评分方法用于评估开放场地环境中的运动（Basso (1995) 12:1-21）。结果显示在
对遭受脊髓损伤并作为对照或如实施例6所述用C3APLT治疗的小鼠检查疤痕的形态学变化和轴突再生。为了研究轴突再生，通过顺行标记鉴定皮质脊髓轴突。对于顺行标记研究，动物如上麻醉，并在运动皮层上移除头骨。使用精细玻璃微量移液器（直径约 100 μm），向大脑皮层注射 2-4 μl 与小麦胚芽凝集素 (2%) 结合的辣根过氧化物酶，这是一种被神经元摄取并顺行转运到大脑的标记物进入脊髓的皮质轴突延伸。注射顺行示踪剂后，更换头骨并用 5-0 丝线缝合皮肤。 48 小时后用水合氯醛 (4.9 mg/10 g) 杀死动物，并灌注含 4% 多聚甲醛的磷酸盐缓冲液作为固定剂。取出脊髓，用蔗糖冷冻保护，并将冷冻切片置于载玻片上用于组织学检查。
Tat 编码序列是通过 SVCMV-TAT 质粒（得自蒙特利尔大学的 Eric Cohen 博士）的聚合酶链式反应获得的，它包含完整的 HIV-1 Tat 编码序列。 PCR 用于分离 Tat 蛋白的转运序列。使用的第一个引物（5'GAATCCAAGCACCAGGAAGTCAGCC 3'（SEQ ID NO.：11））和第二个引物（5'ACC AGCCACCACCTTCTGATA 3'（SEQ ID NO.：12））对应于 HIV Tat 的氨基酸 27 至 72蛋白质。验证纯化后，将PCR产物亚克隆到平端pSTBlue-1载体中。然后使用 EcoR I 和 Sac I 限制位点将 Tat 蛋白的这个转运片段克隆到 pGEX-4T/C3 的 C3 的 3' 端。新的C3-Tat融合蛋白被命名为C3-TL。如实施例3中所述产生重组蛋白。
C3-TL的DNA序列（序列号：13）
TL转运肽本身序列如下：(SEQ ID NO.：46)
C3-TL的蛋白质序列(SEQ ID NO.: 14)
物性
- 分子量 32721.40 道尔顿
- 291个氨基酸
- 43 种强碱性 (+) 氨基酸 (K,R)
- 21 种强酸性 (−) 氨基酸 (D,E)
- 82 个疏水性氨基酸（A、I、L、F、W、V）
- 104种极性氨基酸（N、C、Q、S、T、Y）
- 9.688等电点
- 在 PH 7.0 时充电 22.655
- 翻译碱基总数为876
还制作了一个较短的 Tat 构造 (C3-TS)。为了制备更短的 C3-Tat 融合蛋白，以下寡核苷酸是 5' AAT TCT ATG GTC GTA AAA AAC GTC GTC AAC GTC GTC GTG 3' (SEQ ID NO.: 15) 和 5' GAT ACC AGC ATT TTT TGC AGC AGT TGC AGC AGC ACA GCT 3'（SEQ ID NO：16）。通过合并等量的寡核苷酸，加热至 72°C 5 分钟，然后让寡核苷酸溶液冷却至室温 15 分钟，使两条寡核苷酸链彼此杂交。寡核苷酸在 C3 的 3' 端连接到载体 pGEX4T/C3 中。构建体被测序。将所有质粒转化到感受态 XL-1 Blue 细胞中。如实施例3中所述产生重组蛋白。
C3-TS的核苷酸序列(SEQ ID NO.：17)
TS转运肽本身序列如下：(SEQ ID NO.: 47)
C3-TS的蛋白质序列(SEQ ID NO.: 18)
物性
- 分子量 26866.62 道尔顿
- 238个氨基酸
- 36 种强碱性 (+) 氨基酸 (K,R)
- 21 种强酸性 (−) 氨基酸 (D,E)
- 71 种疏水性氨基酸（A、I、L、F、W、V）
- 78种极性氨基酸（N、C、Q、S、T、Y）
- 9.802 等电点
- 15.212 在 PH 7.0 加载
- 翻译碱基总数为717
以下示例说明了如何在不影响翻译蛋白质效率的情况下修改编码序列。该示例显示了不会影响活动的对 C3Basic3 的更改。序列可以包括整个 GST 序列，如此处所示，其中包括不会被酶促去除的起始位点。此外，由于不同的克隆策略，此示例中显示的转运序列在活性序列周围的氨基酸组成发生了变化，并且省略了 His 标签。然而，活性区是：R R K Q R R K R R (SEQ ID NO：53)。此序列包含在 C3Basic3 中，是以下序列中的主动传输序列。另请注意，在该活性区域之后，蛋白质的 C 末端区域与 C3Basic3 不同。这是因为克隆策略发生了变化，限制性位点不同，因此非必需氨基酸被移植到转运序列的 3' 末端并掺入蛋白质中。
核酸序列：（SEQ ID NO.：19）
- 第1413章
- 单链
- 线性序列
氨基酸序列（SEQ ID NO：20）
- 479个氨基酸
- 线性的，
- 单链
物性
- 分子量 53813.02 道尔顿
- 470个氨基酸
- 68 种强碱性 (+) 氨基酸 (K,R)
- 55 种强酸性 (−) 氨基酸 (D,E)
- 149 个疏水性氨基酸（A、I、L、F、W、V）
- 121种极性氨基酸（N、C、Q、S、T、Y）
- 9.137 等电点
- PH 7.0 时充电 14,106
- 翻译碱基总数为1413
- Davis、Botstein、Roth 熔化温度 C. 79.20
可以将以下序列添加到 C3 的氨基末端或羧基末端或保留其酶促活性的截短的 C3。
- (1) 所描述的聚精氨酸序列（Wender 等人 (2000) 97:13003-8.）。这可以是 6 到 9 个或更多个精氨酸。
- (2) 聚赖氨酸序列
- (3) 多组氨酸序列
- (4) 精氨酸和赖氨酸的混合序列。
- (5) 含有非碱性氨基酸的氨基酸的碱基部分在添加的序列保留运输特性的地方延伸。
- (6) 含有至少50%碱性氨基酸的5-15个氨基酸序列
- (7) 长度超过15-30个氨基酸且至少含有30%碱性氨基酸的序列。
- (8) 长度超过 50 个氨基酸且至少含有 18% 碱性氨基酸的序列。
- (9) 上述任何氨基酸经过化学修饰，例如通过添加环己基侧链、其他侧链、各种烷基间隔物。
- (10) 具有易于螺旋断裂的脯氨酸残基的序列，可作为有效的转运蛋白。
C3Basic1：C3 合并了一个随机设计的基尾
C3Basic2：C3 合并了一个随机设计的基尾
C3 Basic3：C3 融合以逆转 Tat 序列
我们设计了以下编码具有膜转运特性的嵌合 C3 的 DNA。该蛋白质被称为 C3Basic1。该序列是用与随机碱基序列融合的 C3 构建的。该构建体用于编码以下给出的肽。
通过合成下面的两个寡核苷酸、将它们退火在一起并将它们连接到带有添加的组氨酸标签的 pGEX-4T/C3 载体中来构建构建体。
C3Basic1 的 DNA 序列（SEQ ID NO：24）
C3Basic1 的蛋白质序列（SEQ ID NO：25）
物性
- 分子量 29897.03 道尔顿
- 263个氨基酸
- 44 种强碱性 (+) 氨基酸 (K,R)
- 23 种强酸性 (−) 氨基酸 (D,E)
- 75 种疏水性氨基酸（A、I、L、F、W、V）
- 79种极性氨基酸（N、C、Q、S、T、Y）
- 10.024 等电点
- 22,209 在 PH 7.0 充电
- Davis、Botstein、Roth 熔化温度 C. 78.56
我们设计了以下编码具有膜转运特性的嵌合 C3 的 DNA。该蛋白质被称为 C3Basic2。该序列是用与随机碱基序列融合的 C3 构建的。该构建体用于编码以下给出的肽。
通过合成以下两种寡核苷酸、将它们退火在一起并将它们连接到带有添加的组氨酸标签的 pGEX4T/C3 载体中来构建构建体。
C3Basic2 的 DNA 序列（序列号：29）
C3Basic2 的蛋白质序列 (SEQ ID NO.: 30)
物性
- 分子量 29572.61 道尔顿
- 260个氨基酸
- 42 种强碱性 (+) 氨基酸 (K,R)
- 23 种强酸性 (−) 氨基酸 (D,E)
- 74 个疏水性氨基酸（A、I、L、F、W、V）
- 80种极性氨基酸（N、C、Q、S、T、Y）
- 9.956等电点
- PH 7.0 时充电 20,210
- Davis、Botstein、Roth 熔点 C. 78.45
我们设计了以下编码具有膜转运特性的嵌合 C3 的 DNA。该蛋白质被称为 C3Basic3。该序列是用与反向 Tat 序列融合的 C3 构建的。该构建体用于编码下面给出的肽
通过合成以下两种寡核苷酸、将它们退火在一起并将它们连接到带有添加的组氨酸标签的 pGEX4T/C3 载体中，然后亚克隆到 pGEX-4T/C3 中来构建构建体。
C3Basic3 的 DNA 序列（序列号：34）
Proteinsequenz von C3Basic3 (SEQ ID NO.: 35)
物性
- 分子量 29441.47 道尔顿
- 260个氨基酸
- 39 种强碱性 (+) 氨基酸 (K,R)
- 23 种强酸性 (−) 氨基酸 (D,E)
- 76 种疏水性氨基酸（A、I、L、F、W、V）
- 80种极性氨基酸（N、C、Q、S、T、Y）
- 9.833等电点
- PH 7.0 时充电 17,211
- Davis、Botstein、Roth 熔化温度 C. 78.29
从 C3APL 亚克隆到 pGEX 中选出的一个克隆编码的蛋白质不是预期的大小，但具有良好的生物活性。该克隆具有导致截短的移码突变，该克隆被命名为 C3APLT。对克隆重新测序并分析色谱图以确认序列。为了确认 C3APLT 的序列，pGEX-4T/C3APLT 两条链的编码序列通过全长克隆（BioS&T，蒙特利尔，魁北克）的双链测序进行测序。
C3APLT 的 DNA 序列如下：(SEQ ID NO.：36)
APLT转运肽序列本身如下(SEQ ID NO.：48)：
C3APLT的蛋白质序列如下：(SEQ ID NO.：37)
物性
- 分子量 27574.42 道尔顿
- 248个氨基酸
- 33 种强碱性 (+) 氨基酸 (K,R)
- 21 种强酸性 (−) 氨基酸 (D,E)
- 76 种疏水性氨基酸（A、I、L、F、W、V）
- 80种极性氨基酸（N、C、Q、S、T、Y）
- 9.636等电点
- PH 7.0 时充电 12.379
据报道，C3 在大肠杆菌通过 pGEX 系列和 pET 系列载体（例如 Dillon 和 Feig，1995 Meth. Enzymol. 256：174-184。Small GTPases and Their Regulators。Part B. Rho Family。W.E. Balch，C.J. Der 和 A. Hall , eds., Lehmann et al., 1999, supra, Han et al., 2001, J. Mol. Biol. 395: 95-107)。融合蛋白在用于合成和测试的 pGEX 载体中得到良好表达。然而，对于大规模生产，合成不带亲和标签的重组蛋白更有效，这会增加所生产蛋白的大小。此外，使用自动化 FPLC 系统通过亲和层析大规模合成蛋白质更为经济。聚合酶链式反应用于将重组构建体 C3APLT 转移到基于 pET-T7 聚合酶的系统中大肠杆菌表达系统（由 Studier 等人评论，1990. Meth. Enzymol. 185:60-89. Gene Expression Technology. D.V. Goeddel, ed.）。类似的 PCR 方法适用于具有运输序列的基于 C3 的构建体的融合蛋白系列中的其他方法。 pET3a 载体 DNA 获自 Dr.麦吉尔大学的杰瑞·佩尔蒂埃 (Jerry Pelletier)。 PCR 引物获自 Invitrogen。顶部（5'）引物是 5'-GGA TCT GGT TCC GCG TCA TAT GTC TAG AGT CGA CCT G-3（37b）（SEQ ID NO.：38）。下划线是 NdeI 站点，它被引入到引物中以替换 pGEX4T-C3APLT 中的 BamHI 站点。下面的引物是 5'-CGC GGA TCC ATT AGT TCT CCT TCT TCC ACT TC-3' (32b) (SEQ ID NO:39)。该引物在 pGEX4T-C3APLT 的编码链 DNA 中引入了两个变化，将 pGEX4T-C3APLT 的 EcoRI 位点替换为 BamHI 位点（带下划线），并将 TGA 终止密码子替换为强终止序列 TAAT（补充中斜体印刷的 ATTA 序列）底漆）。与 pGEX4T-C3APLT 相比，pET3a-C3APLT 的预测 N 端序列是 Met-Ser 而不是 Gly-Ser-Ser，丢失一个丝氨酸和 Met 替换 Gly。 C3APLT的C端氨基酸序列没有变化。
使用 Pfu 聚合酶（Invitrogen/Canadian Life Technologies）和制造商推荐的缓冲液、DNA 和脱氧核糖核苷酸浓度扩增目标 C3APLT 基因。 PCR如下进行：95℃5分钟，94℃2分钟10个循环，56℃2分钟，70℃延伸2分钟，94℃30个循环2 分钟，然后是 70°C。完成的反应储存在 4°C。 QIAEXII试剂盒(Qiagen)用于纯化含有DNA条带的琼脂糖凝胶切片。根据制造商的说明，用 BamH I 和 Nde I（均获自 New England BioLabs）消化纯化的 PCR 产物 DNA 和载体。通过琼脂糖凝胶电泳将消化产物与外源 DNA 分离，并使用 QIAEXII 试剂盒进行纯化。根据制造商的说明 (New England BioLabs)，将插入物和载体 DNA 在 16°C 下与 T4 DNA 连接酶一起孵育过夜。胜任大肠杆菌（DH5α，购自 Invitrogen/Canadian Life Technologies）用连接混合物进行转化。
使用 Qiagen 的质粒 midi 试剂盒从纯化的菌落中制备 DNA，并使用正向引物 5' AAA TTA ATA CGA CTC 验证的 ACT ATA GGG 通过全长克隆（BioS&T，蒙特利尔，魁北克）的双链测序确定整个插入序列和连接序列3'（24 个碱基）（SEQ ID NO.：40）和反向 T7 终止子测序引物 5' GCT AGT TAT TGC TCAGCG G 3'（19 个碱基）（SEQ ID NO.：41）。 pET 中 C3APLT cDNA 的序列在 SEQ ID NO.:42 中给出。氨基酸序列在SEQ.身份证号码：43。
可以修饰实施例1、2、8、9、10、11、12和13、15和16中给出的任何序列以保留C3酶促活性和有效的转运序列。例如，可以去除代表克隆中使用的限制性位点翻译的序列 3' 端的 DNA 编码氨基酸而不影响活性。也可以去除一些氨基末端氨基酸而不影响活性。融合蛋白C3部分的生物活性所需的最小序列量尚不清楚，但可以通过已知技术容易地确定。例如，可以去除越来越多的编码 C3 的 cDNA 的 5' 端，然后制备所得蛋白质并测试其生物活性。同样，可以去除越来越多的 3' 端，并测试片段的生物活性。接下来，测试中心区域的片段可以测试 C3 活性的保留。因此，蛋白质的 C3 部分可以被截断以仅包含活性所需的氨基酸。或者，可以在 C3 编码区进行突变，然后测试所得蛋白质的活性。可以修改转运序列以添加或去除一个或多个氨基酸或完全改变转运肽，但与我们的组织培养生物测定（实施例 4）中的 C3 相比，保留有效剂量方面的转运特性。如实施例 4 所述，可通过铺板神经元并在抑制性底物上测试它们来测试新的转运序列的生物活性以提高 C3 活性的效率。
如前所述，在组织培养研究中确定可用于在抑制性底物上诱导生长的 C3 的最小量为 25 µg/ml（Lehmann 等人 (1999) J. Neurosci. 19:7537 - 7547 Morii N 和 Narumiya S (1995) Methods in Enzymology vol 256 part B pp 196-206 除非细胞被研磨，否则即使这个剂量也是无效的（
本发明的融合蛋白在促进髓磷脂底物上的神经突长出方面比C3(即单独的)更有效。例如，C3APLT 和 C3APS 的浓度比 C3 所需浓度低 10,000 倍和 1,000 倍时，可产生可比较（相似）的效果，而不会显示出毒性作用（例如对 PC-12 细胞）。 C3-TL 和 C3-TS 也能够以比 C3 低得多的剂量促进髓鞘基质上的神经突生长。体内结果还表明，可能需要较低剂量的融合蛋白来促进小鼠脊髓损伤后的再生和功能恢复。因此，本发明的融合蛋白在制造成本和治疗所需的剂量方面都比C3表现出显着的改进和优势。
通过在基底膜基质 (Matigel) 存在的情况下培养内皮细胞，可以在细胞培养模型中研究新血管的形成。人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) 通过胰蛋白酶化从储备培养物中收获，并重悬于由 EBM-2 (Clonetics)、FBS、氢化可的松、hFGF、VEGF、R3-IGF-1、抗坏血酸、hEGF 组成的生长培养基中。 GA-1000，肝素。 Matrigel (12.5 mg/mL) 在 4°C 下解冻，并将 50 mL Matrigel 添加到 96 孔板的每个孔中，并使其固化 10 分钟。在 37°C。将浓度为 15,000 个细胞/孔的生长培养基中的细胞添加到每个孔中，并使其贴壁 6 小时。本发明的融合蛋白，例如B. 将磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中的 C3APLT 以大约 10 mg/ml 添加到孔中，并将 PBS 添加到其他孔中作为对照。让培养物再生长 6 至 8 小时。管的生长可以通过显微镜在 50 倍放大下观察，毛细管网络的平均长度用 Northern Eclipse 软件量化。在 Matrigel 测定中用本发明的融合蛋白（例如 C3APLT）处理细胞减少管形成（参见
包含单位剂量本发明组合物的溶液，所述组合物包含溶解在药学上可接受的等渗水性介质中的融合蛋白例如C3APLT，所述等渗水性介质包含药学上可接受的缓冲盐和/或微水溶性药学上可接受的碳水化合物（优选药学上非-可接受的还原糖或环糊精）在无菌条件下过滤灭菌（例如通过 0.2 微米过滤器），将滤液置于灭菌小瓶中，将滤液冷冻，将冷冻的水溶液在减压下无菌处理，在药用制剂中冻干可接受的冻干机将包含融合蛋白的干燥基质留在小瓶中，小瓶在无菌惰性气氛下恢复到大气压力，小瓶用无菌塞子密封（例如，连同卷边盖）。密封的小瓶标有其内容物和剂量，以及第二个密封的无菌小瓶，其中装有注射用灭菌水，其量适合转移到第一个装有冻干融合蛋白的小瓶中以完成融合以在试剂盒中重构，将蛋白质基质制成溶液作为单位剂型。或者，可将融合蛋白溶解在起始体积的包含高渗水性介质的水性介质中，将溶液过滤除菌，将滤液装入小瓶中并冻干以形成干燥基质。这种干燥的基质可以在大于原始体积的无菌水中溶解或重构，更大的体积足以形成用于注射的等渗溶液，例如通过静脉内注射和/或输注。或者，高渗溶液可用于通过输注到含有较大体积的等渗水性介质的滴袋中给药，使得高渗溶液基本上被稀释。任选地，含有足以将基质重构为单位剂型的一定体积无菌水的小瓶与冻干蛋白质一起作为试剂盒出售。优选地，重构的组合物包含等渗溶液。融合蛋白可与该制剂一起用于静脉内递送和/或输注和/或直接注射到眼组织或眼近端组织中。
C3-07 是缺少 GST 序列的 C3APLT 的衍生物。 C3-07 通过聚合酶链式反应制备并亚克隆到 pET9a 载体中以生成 C3-07。 C3-07 与 C3-05 的不同之处在于沉默的氨基酸变化，可以描述为 C3-05 中末端甘氨酸的缺失，提供以丝氨酸结尾的 C3-05 的截短片段，加上突变（即取代）该末端丝氨酸在被甲硫酮截短的片段中产生 C3-07。 C3-07Q189A 是通过故意在融合蛋白中 ADP-核糖基转移酶催化位点附近的 C3-07 中产生突变而产生的，从而大大降低 ADP-核糖基化活性。设计了两个寡核苷酸，通过使用 QuikChange (Stratagene) 的定点诱变将活性位点氨基酸 189 谷氨酰胺（gln，Q，由 CAA 编码）改变为 189 丙氨酸（ala，A，由 GCA 编码）。使用 50 ng 的“pET9a-BA-207”（有时称为“pET9a-BA05”）、133 ng 的 41 聚体突变引物 ZSM3 和 137 ng 的 41 聚体突变引物在热循环仪中进行聚合酶链式反应ZSM4。 Q189A突变体的循环程序如下：95℃30秒，95℃30秒，55℃1分钟，68℃10分钟，4℃保持18个循环。
上述序列中的粗括号表示从 C3-07 序列的变化。
C3-07的氨基酸序列为SEQ ID NO.：43。
C3-07的cDNA序列为SEQ ID NO.：42。
根据制造商的说明进行 DpnI 消化，并使用 1 µl 该产品来转化 XL1-Blue 感受态细胞。然后将这些板在 37°C 下孵育过夜。选择推定的 C3-07Q189A 的克隆，并使用 Qiagen Midi 试剂盒扩增和纯化它们的质粒 DNA。通过限制性消化分析来分析纯化的质粒。使用 T7 和 T7T 引物在 BioS&T（Lachine，Quebec）对三个候选克隆的 DNA 进行测序。突变体ZSMT2-2被证实含有突变，DNA用于转化BL21（DE3）细胞并制备研究细胞库（RCB）。
纯化的 C3-07Q189A 是从大肠杆菌.首先，将 2 瓶 pET9a-C3-07Q189A 研究细胞库 (RCB) 接种到装有葡萄糖的 Luria 肉汤的 0.5 L 烧瓶中，并培养过夜。起子培养物在每个含有 500 毫升生长培养基的 8 个烧瓶中稀释 10 倍。烧瓶在 37°C 下孵育，1 小时 20 分钟后，加入异丙硫基-B-D-半乳糖苷 (IPTG) 以增加 C3-07Q189A 的表达。再过 4 小时后，通过离心收集细胞并储存在 -80°C 下直至需要。分析收获的培养物样品的 C3-07Q189A 含量。接下来，将细胞解冻并进行初步收获，即在用于生产 C3-07 的研究规模方法中在提取缓冲液中进行超声处理。粗提物用带正电荷的聚合物处理以去除核酸，并用硫酸铵处理以去除一些蛋白质并减少体积。除去过量的盐。通过四个色谱柱进一步纯化蛋白质。最后的纯化和分离步骤包括浓缩所得纯化蛋白溶液（可使用超滤）、过滤蛋白溶液（例如，通过 0.2 微米过滤膜，可用于对蛋白溶液进行灭菌）、分配溶液放入无菌试管中，冷冻蛋白质溶液并冻干冷冻溶液以留下粉末形式配制的蛋白质。在纯化 C3-07Q189A 后，分析融合蛋白以确定产生的蛋白质的量、其纯度、效力和生物活性（例如，ADP-核糖基转移酶相关的轴突生长活性）。通过考马斯蓝染色的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶的扫描密度测定法测量纯度。 C3-07Q189A 的活性使用 NG108 细胞 4 小时神经突长出生物测定来确定。生物测定的程序包括将 hNG-108 细胞与含有 C3-07Q189A 的缓冲溶液等分试样一起孵育 4 小时。使用 C3APLT 或 C3-07 代替 C3-07Q189A 进行同时的和其他方面相同的生物测定作为阳性对照。然后用多聚甲醛固定细胞，用甲酚紫染色，并通过在显微镜下计数确定每个孔中显示长于一个细胞体的神经突的细胞百分比。每个数据点一式三份确定。
C3-07Q189A的氨基酸序列如下：
C3-07Q189A 的蛋白质序列
C3-07Q189A的cDNA序列如下：
C3-07Q189A的cDNA序列
C3-APLT和C3-07是本发明的融合蛋白的实例，每种蛋白都具有ADP-核糖基转移酶活性并且各自具有ADP-核糖基转移酶活性位点。
在视觉系统中，视网膜神经节细胞在视神经受伤后死亡。严重程度（即死亡细胞的数量）和细胞死亡率取决于轴突损伤与眼睛的接近程度。为了研究 Rho 失活对 RGC 存活的影响，我们使用了 C3 转移酶的两种细胞膜穿透（即细胞膜可渗透）衍生物：C3-APLT 和 C3-07。
大鼠用 2-3% 的异氟醚麻醉。用 Fluorogold (Fluorochrome Inc, Denver, Colorado) 从上丘逆行标记 RGC。通过在骨头上做一个小的圆形开口来暴露大鼠的右中脑，然后抽出皮质并去除覆盖在上丘上的软脑膜物质。将一小块浸泡在包含 2% 氟金和 10% DMSO 的水性介质中的明胶海绵应用于右上丘的表面。应用 Fluorogold 后 7 天，从眼睛 1 毫米处横断左侧视神经。通过在覆盖眼眶骨上缘的皮肤上做一个矢状切口，在眼眶内接近视神经，注意保持眶上静脉完好无损。泪腺部分切除或反折后，用小牵开器或6-0丝线缝合上眼外肌。暴露视神经并纵向切开周围的鞘管以避免在暴露视神经时切割血管。切开视神经的软脑膜，轻柔地操纵视神经将其取出，然后将剪刀从视神经下方切开，在距离眼睛1mm处进行干净的切割。在用于研究细胞因子水平的动物中使用微压伤损伤。对于这些研究，软脑膜保持完整，视神经从鞘中切除，并通过用 10.0 缝合线收缩 60 秒将视神经压离球体 1 毫米。
麻醉动物在视神经横断后立即或 4 天后接受单次注射 C3APLT 或 C3-07 水溶液。使用连接到玻璃微量移液器的 10 µl 注射器进行眼内注射。在插入玻璃吸管以注入 5 µl 融合蛋白（例如 C3-07）或缓冲液对照之前，用 30 g 针头在距乳头约 4 mm 的上鼻视网膜上打孔。缓慢抽出针以使溶液扩散到玻璃体腔中。然后用组织粘合剂（Indermil，Tyco Heathcare，Mansfield，USA）密封巩膜。注意不要在注射过程中损坏晶状体，以避免白内障形成和随之而来的 RGC 存活率增加。闭合皮肤并通过术后检眼镜检查评估视网膜血管的完整性。血管系统受损的大鼠或发生白内障的大鼠不包括在实验结果中。
荧光金标记的视网膜在轴突切开术后 7 或 14 天准备好用于计数。给动物灌注 4% 多聚甲醛 (PFA)，在角膜穿刺后将它们的眼睛取出并固定在 4% PFA 中。然后用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 冲洗眼睛 1 小时。在每只眼睛的四个视网膜象限中切开切口，取出视网膜并平放在载玻片上。用纸芯擦去多余的玻璃体。将盖玻片放在附着的视网膜上方的载玻片上，并用紫外线过滤器 (365/420) 检查 RGC。标记的 RGC 在显微镜下以 20 倍放大率在显微镜的视野中使用矩形插入物进行计数，以提供 0.375 毫米 x 0.1125 毫米的矩形视野区域。距离视盘 1 和 2 毫米的四个标准矩形视网膜区域被计数。每个区域标记的细胞数除以 0.04125（以 mm 为单位计算的矩形面积2个) 并且每个视网膜的平均密度计算为 RGCs/mm2个.细胞计数由对治疗不知情的同一检查者进行。荧光金也存在于轴突切除术后的内皮细胞和小胶质细胞中。那些通过形态学鉴定的细胞被排除在 RGC 计数之外。使用 Excel 进行统计，并通过 t 检验将处理动物的结果与对照组的结果进行比较。
单次注射 FPLC 纯化的 C3APLT 具有神经保护作用，并在轴突切开术后 7 天拯救了所有 RGC，而单次注射 FPLC 纯化的 C3-07 具有神经保护作用，并在轴突切开术后 7 天拯救了所有 RGC。为了确定 C3-07 注射后 RGC 细胞存活率是否可能因为 C3-07 的特性而不是其 Rho-核糖基化活性而增加，我们测试了 C3-07Q189A 对 RGC 细胞存活率的影响。突变蛋白 C3-07Q189A 通过 FPLC 纯化，并在轴突切开后立即以用于 C3-07 的方式注射 1 µg。施用 C3-07Q189A 后的细胞存活率与单独轴突切开后的细胞存活率没有显着差异，并且与 C3-07 的作用有显着差异（
可通过眼内注射盐水增加眼内压，在白化病 Lewis 大鼠的视网膜中诱导局部缺血（Unoki 和 LaVail，Invest Opthalmol Vis. Sci. 35:907, 1994）。如上所述，可以通过计算整个视网膜植物中 Florogold 逆行标记的 RGC 来评估 RGC 的存活率。
可以在皇家外科医学院 (RCS) 大鼠中证明光感受器细胞的拯救，该大鼠具有遗传性视网膜变性（Factorovich 等人，Nature 347:83, 1990）。使用连接到玻璃微量移液器的 10 µL 注射器在水性缓冲液中眼内注射 C3APLT。在插入玻璃吸管以注入 5 微升 1 微克 C3-APLT 或缓冲液对照之前，使用 30 克针头在距离乳头约 4 毫米的上鼻视网膜上打一个孔。缓慢抽出针以使溶液扩散到玻璃体腔中，并用组织胶封闭巩膜。注意不要在注射过程中损坏晶状体，因为晶状体损伤会导致白内障形成，从而延长 RGC 的存活时间。关闭皮肤并通过术后检眼镜检查评估视网膜血管的完整性。血管系统受损的大鼠或患白内障的大鼠不包括在实验结果中。
用于评估经治疗或未经治疗的 RCS 大鼠光感受器存活的组织学分析包括以下步骤：对麻醉动物进行血管灌注、将动物的眼睛包埋在石蜡中，以及用苏木精和伊红或甲苯胺蓝对 6 微米厚的切片进行染色。在产后第 53 天 (P53) 未经治疗的 RCS 大鼠眼中，含有感光细胞的外核层厚度减少到只有几排细胞（约为同龄正常大鼠厚度的 20%） .通过玻璃体内给药（例如，包含一微克蛋白质的单次注射）给予治疗有效剂量的 C3APLT 可以恢复外核层的厚度，从而拯救感光细胞。
或者，可以根据 LaVail 等人的方法，在恒定光照模型（115-200 英尺烛光）中使用 2-3 个月大的雄性 Sprague-Dawley 大鼠进行 1 周的感光细胞拯救。被证明。 PNAS USA 89:11249, 1992，其公开内容通过引用并入本文。在开始连续照明（1 微克蛋白质）之前 48 小时，可以将 C3APLT 的水性缓冲溶液注射到视网膜下空间或玻璃体中。在指定的恢复期（通常为 10 天）后对视网膜进行组织学检查和分析，用于评估光感受器细胞的死亡或损伤以及挽救或存活。
视网膜脱离也会导致感光细胞死亡。一个来自 Erickson 等人，J Struct。生物学。 108:148, 1992，其公开内容通过引用并入本文，可以显示与缓冲液对照的施用相比，施用 C3APLT 以增加体外视网膜细胞存活的效果，突变的蛋白质消除以增加 ADP-核糖基化活性，改善，并成为未经处理的控制。
光感受器变性的几种小鼠遗传模型（例如 cGMP 磷酸二酯酶 b-亚基 rd 突变体、外周蛋白 rds 突变体）可以使用上述给药方式来产生融合蛋白相关（例如 C3APLT 相关）光感受器细胞，以证明增强的存活效果体内。
Rd突变小鼠和rds突变小鼠在出生后数周内出现视网膜退化。如上所述玻璃体内注射融合蛋白（例如，C3APLT）后，通过上述组织学方法分析组织。
可以使用 Caffe 等人，Curr 中描述的方法测试在含有 C3APLT 的培养基中培养的 rd 突变小鼠的视网膜外植体的外核层厚度。眼睛水库12:719, 1993，其公开内容通过引用并入本文。因此，小鼠幼崽在出生后 48 小时被去核并用蛋白酶 K 处理。在这种酶处理后，收获带有附着的视网膜色素上皮细胞 (RPE) 的神经视网膜，置于多孔培养皿中，并在 1.2 mL 培养基（例如 R16）中在 37°C 下孵育长达 4 周5% 二氧化碳。固定（例如 4% 多聚甲醛）切片视蛋白的免疫细胞化学染色用于评估感光细胞退化和补救。在 rd 突变小鼠中，外核层（感光细胞）在培养 2 至 4 周后退化。培养基可以补充一系列剂量的 C3APLT，以对视网膜细胞功能产生影响，例如： B. 从退化中拯救外核层。还可以使用 TUNEL 方法对上述模型中分析的视网膜部分进行演示，以证明生存效果。
不受控制的视网膜血管生成可能导致许多视网膜疾病的病理学，例如： B.湿性黄斑变性、色素性视网膜炎、斯塔加特氏病、糖尿病性视网膜病、高血压性视网膜病和闭塞性视网膜病。视网膜缺氧会增加血管内皮生长因子 (VEGF) 的产生，从而诱导视网膜新生血管形成。
缺血诱导的视网膜新生血管形成的小鼠模型使用新生 C57BL/6J 小鼠，这些小鼠从出生后第 7 天到第 12 天暴露在 75% O2 中，连同它们的哺乳母亲，然后返回室内空气。为此，小鼠在第 7 天称重并放置在用作氧气室的有机玻璃盒中，连同足够的食物和水放置 5 天，直到第 12 天。通过箱子的氧气流速为 1.5 L/min，维持 5 天。使用 Beckman 氧气分析仪（型号 D2，Irvine CA）每天检查两次流速。在高氧的 5 天内，腔室不会打开。在 P12 天进行融合蛋白（例如 C3APLT）的眼内注射，并将小鼠置于环境空气中，诱导缺氧。在第 17 天，通过用生理盐水心脏灌注，然后用 4% 多聚甲醛 (PF) 处死小鼠，将它们的眼睛取出并固定在 PF 中过夜。然后冲洗眼睛，通过分级酒精系列，然后切下 6 µm 厚的径向切片。视盘切片用高碘酸/希夫试剂和苏木精染色。间隔 30 µm 的部分通过视网膜评估 300 µm 的跨度。在内界膜前面的所有视网膜核在每个部分中都被计数。确定计数的 10 个切片的平均值，以给出每只眼睛每个切片的新生血管核的平均数。在正常的、未经处理的动物中，在界膜前没有观察到血管细胞核。与不存在融合蛋白时观察到的数目相比，融合蛋白的施用显着减少了视网膜血管核的数目。